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研究目的与意义急性肾损伤(acute kidney injury,AKI),又称急性肾功能衰竭,是临床住院及重症患者高发的一类严重的肾病综合征,其发病率和死率高、并发症多、病因复杂。临床上AKI以肾脏缺血及缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)、肾毒性药物、病菌感染为高发诱因。目前仍缺乏提高AKI患者生存率、改善肾脏损伤和增强肾脏损伤后修复的有效治疗策略。而在充分了解AKI致病机制的基础上,进行新型诊断和治疗方法的研发,是改善AKI患者临床转归和生活质量的重要手段。大量的研究证实,免疫系统介导的炎症反应等免疫学机制和急性肾小管坏死、血流动力学改变等病理生理学机制是AKI致病机制的核心理论。炎症是几乎所有类型肾损伤的特征性表现,模式识别受体介导的固有免疫应答在急性肾损伤的起始、扩展和消退过程中发挥着重要作用。小鼠p204是干扰素诱导蛋白200(interferon-inducible protein 200,p200)家族的成员之一,是人干扰素诱导蛋白IFI16在小鼠中的最接近同源物。p204蛋白在小鼠多种器官组织和细胞中基础性表达,如心肌、骨骼肌、肾、骨、骨髓、胸腺、淋巴结、脾、单核/巨噬细胞等。IFI16/p204作为模式识别受体中DNA感受器分子家族成员在多种病理生理过程中具有重要作用。近期的研究显示p204是脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)-TLR4信号通路的重要组成部分,p204通过其Pyrin结构域与TLR4结合,与LPS诱导的TLR4二聚及其下游信号通路的激活有关,p204是巨噬细胞中LPS诱导IFN-β产生和炎症反应的关键胞内介质,提示p204可能是预防和治疗炎症和感染性疾病的潜在靶点。然而p204在AKI中的表达与功能尚不清楚。本研究利用缺血再灌注诱导的急性肾损伤研究模型,初步分析p204在急性肾损伤中表达特征与功能,为AKI致病机制研究及寻找治疗靶点提供前期基础。研究方法1.表征缺血再灌注诱导的AKI中p204的肾脏表达特性1.1 p204在肾缺血再灌注小鼠肾组织中的表达变化选取12周龄C57BL/6雄性野生型小鼠(wildtype,WT)。小鼠麻醉后于加热垫上进行开腹手术,使用微动脉夹法夹住双侧肾蒂阻止血流,造成缺血30分钟后随即打开动脉夹恢复血流,建立缺血再灌注诱导的AKI小鼠模型;再灌注24小时后处死小鼠,采集血液并获取肾组织样本。提取肾组织总蛋白和总RNA并制作肾组织石蜡切片,分别使利用Western blot(WB)、Real-time RT-PCR和免疫组织化学染色(immunohistochemistry,IHC)等方法检测p204在缺血再灌注小鼠肾组织中表达变化、分布及亚细胞定位。1.2缺氧-复氧条件下人肾小管上皮细胞HK-2中IFI16的表达变化分别采用0.1%低氧环境培养HK-2细胞2小时后更换完全培养基进行正常培养,或者使用抗霉素A/2-脱氧葡萄糖处理HK-2细胞90分钟后更换完全培养基进行正常培养,或者使用不同浓度氯化钴(CoCl2)处理HK-2细胞12小时。Western blot法检测HK-2细胞中IFI16的蛋白水平,分析缺氧-复氧条件下人肾小管上皮细胞中IFI16表达变化。2.p204在小鼠肾缺血再灌注损伤中的功能2.1野生型与p204基因缺失的缺血再灌注小鼠肾脏功能指标分析利用野生型小鼠和p204基因缺失型(p204-/-)小鼠建立缺血再灌注诱导的AKI模型,收集小鼠外周血并制作血清,使用高效液相色谱法和全自动生化分析仪分别测定小鼠血清中肌酐和尿素氮的含量。2.2野生型与p204基因缺失的缺血再灌注小鼠肾脏形态学损伤分析收取假手术组(Sham)和缺血再灌注组(I/R)野生型与p204-/-小鼠肾组织,取肾皮质石蜡包埋并制作切片,使用苏木素-伊红染色评估小鼠肾脏形态学损伤;采用组织免疫荧光染色法检测肾脏损伤分子-1(kidney injury molecule 1,KIM-1)在各组小鼠肾脏中的表达情况;使用脱氧核苷酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling,TUNEL)技术对各组小鼠肾脏石蜡切片染色,分析肾小管上皮细胞死亡。2.3小鼠肾缺血再灌注模型炎症相关指标的检测假手术组和缺血再灌注组野生型与p204-/-小鼠肾组织切片进行IHC染色,分别检测中性粒细胞和巨噬细胞特异性标志蛋白Ly6B和CD68,判断p204基因缺失对I/R诱导的肾脏炎性细胞浸润的影响。2.4 IFI16对缺氧-复氧诱导的HK-2细胞炎症及细胞凋亡的影响转染IFI16特异性siRNA(siRNA-IFI16)沉默HK-2细胞中IFI16表达后,使用抗霉素A/2-脱氧葡萄糖处理后恢复正常培养;分别使用Real-time RT-PCR法和Annexin V/PI染色-流式细胞术检测沉默IFI16表达对抗霉素A/2-脱氧葡萄糖培养条件下HK-2细胞中炎性因子mRN A表达水平和细胞凋亡率的影响。研究结果1.表征缺血再灌注诱导的AKI中p204的肾脏表达特性1.1I/R小鼠肾组织中p204表达显著升高mRNA和蛋白质表达分析证实在I/R组小鼠肾皮质提取物中p204表达水平均显著高于假手术组;IHC染色观察则发现p204主要在肾小管上皮细胞细胞核内表达,而且I/R组受损的小鼠肾小管上皮细胞核内的p204显著较假手术组升高。1.2体外缺氧-复氧促进HK-2细胞中IFI16的表达三种方法体外模拟缺血再灌注环境处理的肾小管上皮细胞HK-2中IFI16的表达均较对照组细胞显著升高。2.p204基因缺失在I/R诱导的AKI中具有保护作用2.1 p204基因缺失减轻肾缺血再灌注损伤小鼠肾功能检测发现,在I/R小鼠中,p204基因缺失显著降低血肌酐和尿素氮水平;组织形态学染色、KIM-1免疫荧光染色、TUNEL染色及Ly6B和CD68 IHC染色证明,与I/R组野生型小鼠相比,I/R组p204-/-小鼠肾小管上皮细胞损伤明显减轻、细胞死亡显著减少、浸润的中性粒细胞及巨噬细胞的数量明显降低。2.2抑制IFI16表达缓解抗霉素A/2-脱氧葡萄糖诱导的HK-2细胞的炎症反应与凋亡抑制HK-2细胞中IFI16的表达可显著降低抗霉素A/2-脱氧葡萄糖诱导的HK-2细胞中MCP-1、IL-1β、IL-6和IL-18等炎性介质的表达升高及凋亡细胞比例的增多。研究结论与创新性本研究以缺血再灌注诱导的急性肾损伤为模型,首次阐明了p204在急性肾损伤中的作用。发现在缺血再灌注模型小鼠肾脏中,p204的表达明显升高;p204基因缺失可显著减轻肾小管细胞的凋亡、炎性细胞的浸润和炎性介质的释放,进而缓解急性肾损伤,提示p204参与急性肾损伤的致病机制。