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第一部分Sublytic C5b-9上调TRADD和IRF-1表达对Thy-1肾炎大鼠肾小球系膜细胞凋亡的影响及其分子机制目的:检查Thy-1肾炎（Thy-1 nephritis,Thy-1N）大鼠的肾组织和受亚溶解型（sublytic）C5b-9复合物刺激的大鼠肾小球系膜细胞（glomerular mesangial cell,GMC）中肿瘤坏死因子受体1相关含死亡结构域蛋白（TNFRl-associated death domain-containing protein,TRADD）、干扰素调节因子 1（interferon regulatory factor 1,IRF-1）表达情况。确定过表达或沉默TRADD或IRF-1对sublytic C5b-9刺激GMC上调半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶8（cysteinyl aspartate specific proteinase 8,caspase 8）表达与活化及其诱发GMC凋亡的影响。明确sublytic C5b-9刺激GMC上调的TRADD和IRF-1之间的上下游关系。方法:复制大鼠Thy-1N模型,同时用sublytic C5b-9刺激体外培养的大鼠GMC,通过western blot检查实验不同时间点的肾组织（体内）及GMC（体外）中TRADD、IRF-1基因的表达水平。另构建TRADD和IRF-1的真核过表达质粒以及用于沉默TRADD和IRF-1基因的发夹状小干涉RNA（short hairpin RNA,shRNA）的真核表达载体,将这些质粒分别转染GMC后,再行sublytic C5b-9刺激,用western blot检查过表达或沉默TRADD和IRF-1的效果,同时用western blot或TUNEL法检查受sublytic C5b-9刺激诱导的GMC中caspase 8的表达与活化水平及GMC的凋亡率。此外,用western blot检查受sublytic C5b-9刺激的GMC中IRF-1和TRADD的表达变化。结果:大鼠Thy-1N发病后肾组织和受sublytic C5b-9刺激的GMC中,TRADD和IRF-1水平均明显上调,并于实验3h时达到高峰。过表达或沉默TRADD或IRF-1均可分别促进或抑制由sublytic C5b-9引发的GMC中caspase 8表达和活化以及GMC的凋亡。另沉默TRADD基因对sublytic C5b-9诱导GMC表达IRF-1并无影响,而沉默IRF-1基因则能明显抑制sublytic C5b-9上调GMC中TRADD的表达水平。结论:（1）Thy-1N大鼠肾组织及受sublytic C5b-9刺激的GMC中TRADD和IRF-1蛋白水平均显著上升;（2）Sublytic C5b-9作为启动原刺激GMC上调的TRADD和IRF-1均是参与诱生和活化caspase 8,继而引起GMC凋亡的关键分子;（3）Sublytic C5b-9刺激GMC上调的TRADD受IRF-1调控,IRF-1为TRADD的上游分子。提示,大鼠Thy-1N时,sublytic C5b-9刺激GMC后可上调表达TRADD、IRF-1和caspase 8分子。其中,高表达的IRF-1可促进下游TRADD和caspase 8的表达,而TRADD又能进一步活化caspase 8,最终导致了 GMC的凋亡。第二部分Sublytic C5b-9刺激GMC上调IRF-1和TRADD基因表达及诱导GMC凋亡的信号通路目的:研究sublytic C5b-9刺激大鼠GMC上调TRADD和IRF-1表达,继而诱导GMC凋亡的上游信号通路及其调控机制。方法:首先,利用western blot检查受sublytic C5b-9刺激后,GMC中JNK、ERK、p38 MAPK信号通路的活化情况,并通过TUNEL法检查分别抑制JNK、ERK、p38 MAPK对sublytic C5b-9引发GMC凋亡的影响,确定凋亡相关的信号通路。然后,通过免疫沉淀（IP）和 western blot 检查受 sublytic C5b-9 刺激的 GMC 中,MAP3K（ASK1、MEKK2和MEKK4）的活化情况。另构建MEKK2shRNA表达载体并转染GMC以沉默MEKK2基因,通过TUNEL法检测其对sublytic C5b-9触发GMC凋亡的影响。同时,通过western blot检查其对sublytic C5b-9诱导GMC活化p38 MAPK和caspase 8以及上调IRF-1、TRADD和caspase 8表达的作用。最后,采用IP联合SDS-PAGE凝胶银染割胶,纯化受sublytic C5b-9刺激后GMC中的MEKK2,通过蛋白质谱仪分析和鉴定其磷酸化位点,并构建MEKK2野生型及各磷酸化位点失活型突变体的过表达载体,再通过western blot检查分别转染各突变体后对sublytic C5b-9 刺激 GMC 活化 p38 MAPK 的影响。结果:（1）Sublytic C5b-9 能激活GMC中JNK、ERK和p38 MAPK信号通路;（2）阻断p38 MAPK通路可显著抑制由sublytic C5b-9引起的GMC凋亡和caspase 8活化以及GMC中IRF-1、TRADD 和 caspase 8 的表达;（3）受 sublytic C5b-9 刺激 40～60min 时,GMC 中MEKK2可发生磷酸化;（4）沉默MEKK2能抑制由sublytic C5b-9引起的p38 MAPK活化、IRF-1和TRADD表达上调以及caspase 8表达上调和活化,包括GMC的凋亡;（5）分别将MEKK2 153位、164位和239位丝氨酸失活型突变体导入GMC后均可抑制由sublytic C5b-9刺激引起的GMC中p38 MAPK活化。结论:Sublytic C5b-9刺激GMC后,其细胞中的MEKK2 153位、164位和239位丝氨酸能被磷酸化激活,继而参与活化p38 MAPK。活化的p38 MAPK可促进IRF-1表达,并上调TRADD和caspase 8的表达,而高表达的TRADD又能促进caspase 8的活化,最终促使了 GMC的凋亡。第三部分沉默MEKK2、IRF-1和TRADD基因或抑制p38MAPK对大鼠Thy-1肾炎病变的影响目的:探讨分别沉默大鼠肾组织中MEKK2、IRF-1和TRADD基因或抑制p38 MAPK对Thy-1N大鼠肾内GMC凋亡和后续增生病变的影响。方法:首先,构建MEKK2shRNA、TRADDshRNA慢病毒表达载体,同时通过侵染实验检查其病毒滴度并确定其侵染GMC的能力。然后,通过肾动脉灌注法将MEKK2 shRNA、IRF-1 shRNA（以往本室保存）、TRADD shRNA慢病毒载体分别导入大鼠肾组织,另设组将p38抑制剂SB203580注射入大鼠腹腔,再经尾静脉注射抗胸腺细胞血清（anti-thymocyte serum,ATS）以复制大鼠Thy-1N模型。分别于注射ATS（含Thy-1抗体,Thy-1 Ab）后60min,3h和7d取大鼠肾组织,应用westernblot检查60min时肾组织中p38 MAPK的活化情况,同时检查3h时肾组织中IRF-1、TRADD和caspase 8的表达水平。另采用TUNEL法和电镜检查3h时肾内GMC的凋亡病变。此外,用光镜检查7d时,大鼠肾小球内细胞总数的变化,并用电镜检查7d时肾小球系膜区的增生改变。最后,检查各组大鼠发病第6d时尿蛋白总量的变化。结果:（1）MEKK2shRNA、TRADDshRNA慢病毒表达载体成功构建,两载体均具有侵染GMC的能力,且病毒滴度较高;（2）沉默大鼠肾组织中MEKK2可显著抑制p38 MAPK的活化;（3）分别沉默大鼠肾组织中MEKK2、IRF-1和TRADD基因或抑制p38 MAPK均可显著抑制减少实验3h时肾组织中caspase 8的活化及GMC的凋亡;（4）分别沉默大鼠肾组织中MEKK2、IRF-1和TRADD基因或抑制p38 MAPK也能减轻实验7d时Thy-1N大鼠肾小球GMC的增生病变和降低患病大鼠的尿蛋白分泌。结论:沉默大鼠肾组织中MEKK2、IRF-1和TRADD基因或抑制p38 MAPK可抑制Thy-1N大鼠早期（3h）肾内GMC的凋亡病变,并减轻Thy-1N大鼠发病7d后肾小球内GMC的增生和ECM的积聚。同时,患病大鼠尿蛋白的分泌水平也明显下降。提示,MEKK2-p38 MAPK-IRF-1-TRADD级联反应中任一环节的阻断均能减轻Thy-1N大鼠肾组织的病理损伤。