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目的:阐明蜕膜NK细胞表面抑制性分子Tim-3在孕期弓形虫感染所致不良妊娠结局中的作用机制。方法:体外实验:采集正常早孕期(怀孕40-60天)人工流产的蜕膜组织,酶消化法与机械法无菌获取人原代蜕膜细胞。利用磁珠分选纯化得到CD3-CD56+NK细胞,构建人原代蜕膜NK细胞的培养体系。将细胞分为三组,正常NK细胞组,弓形虫感染NK细胞组,使用Tim-3抗体中和处理的弓形虫感染NK细胞组(Tim-3抗体中和感染组)。弓形虫感染NK细胞组与Tim-3抗体中和感染组,以弓形虫速殖子数:NK细胞数为2:1的比例,感染36小时,正常组NK细胞补充等量培养液。Tim-3抗体中和感染组需在感染前使用Tim-3中和抗体预处理2小时。使用流式细胞术检测以上培养体系中NK细胞表面Tim-3的表达情况、蜕膜NK细胞表面抑制性受体(KIR2DL4)及活化性受体(NKG2D)、蜕膜NK细胞杀伤性介质(GranzymeA、GranzymeB、Perforin)及细胞因子(IL-10、IFN-γ)的表达水平。并对Tim-3可能参与调节蜕膜NK细胞功能分子的信号通路(PI3K-AKT及Jak-Stat)进行探究。使用 Western blot 技术检测各组蜕膜 NK 细胞 Tim-3、PI3K、pAKT、pStat1、pStat3、GranzymeA、GranzymeB、Perforin、及相关细胞因子IL-10、IFN-γ的表达水平改变。体内实验:以C57BL/6野生型小鼠为实验对象,委托公司构建相同背景的Tim-3基因敲除鼠模型(Tim-3-/-),通过杂交,获得Tim-3-/-纯种。实验分为Tim-3-/-感染孕鼠、野生感染孕鼠及正常孕鼠共三组。Tim-3-/-感染孕鼠及野生感染孕鼠均gp d于孕7天(gd7)通过腹腔注射刚地弓形虫RH株速殖子400条,正常组孕鼠于gd7注射等体积量PBS作为对照。于gd11天观察各组孕鼠的生理状态,包括精神表现及活动度。采用后颈椎脱臼法处死以上孕鼠,解剖胎鼠与胎盘,对比孕鼠妊娠结局情况并记录正常胎鼠数、异常胎鼠数(死胎及吸收胎数),对比胎盘外观及是否出血缺血。胎鼠胎盘情况均拍照。后分别称量各组胎盘重量、胎鼠重量并统计分析。另外留取三组胎鼠作为扫描电镜样本,以观察三组胎鼠的发育情况。后续对三组胎盘组织进行HE染色观察胎盘组织内炎症、出血等情况。无菌分离三组孕鼠的蜕膜和胎盘组织,机械法及Ficoll密度梯度离心法获取蜕膜胎盘的单个核淋巴细胞悬液,流式细胞术检测各组蜕膜NK细胞表面Tim-3的表达水平;NK抑制性膜受体NKG2A及活化性膜受体NKG2D的表达差异;蜕膜NK细胞杀伤性介质(GranzymeA、GranzymeB、Perforin)及细胞因子(IL-10、IFN-γ)的表达水平。结果:体外实验:结果显示,人蜕膜NK细胞表面Tim-3表达水平在感染弓形虫显著降低;感染组人蜕膜NK细胞表面KIR2DL4、NKG2D表达水平较正常组明显升高,NKG2D/KIR2DL4比值增大;蜕膜NK细胞胞内GranzymeA、GranzymeB、Perforin较正常组明显上升;蜕膜NK细胞分泌IL-10、IFN-γ水平均呈上升趋势,以IFN-γ上升幅度更明显,IFN-γ/IL-10比值较正常组在增加。为验证蜕膜NK细胞表面Tim-3对其以上功能分子的影响,在Tim-3中和抗体感染组中对以上分子进一步检测。结果显示,较弓形虫感染NK细胞组,Tim-3抗体中和感染组NKG2D表达水平较感染组明显升高,KIR2DL4与感染组无明显统计学差异,但NKG2D/KIR2DL4比值较感染组进一步增大;Tim-3抗体中和感染组人蜕膜NK细胞 GranzymeA、GranzymeB、Perforin 的表达水平明显升高;此外,IFN-γ/IL-10 比值明显增加。本研究还发现,弓形虫感染后,蜕膜NK细胞Tim-3表达下降可导致细胞内PI3K、pAKT、pStat1、pStat3的表达水平明显上调。体内实验:弓形虫感染后,Tim-3-/-感染组及野生感染组孕鼠均出现明显的不良妊娠结局,且Tim-3-/-感染组较感染组妊娠结局更差,孕鼠精神状态更加萎靡,孕鼠消瘦颤栗伴随耸毛、弓背现象更加明显;胎鼠、胎盘重量进一步减轻;胎鼠外观更小且不成形。HE切片结果显示,镜野下Tim-3-/-感染组胎盘出血和炎性细胞浸润情况也更加严重。电镜结果显示:Tim-3-/-感染组胎鼠大小明显小于野生感染组,头部发育及手板脚板发育缓慢,较感染组发育不良情况更加严重。流式结果表明,弓形虫感染后,蜕膜NK细胞表面Tim-3表达降低;蜕膜NK细胞活化性膜受体NKG2D及抑制性膜受体NKG2A表达升高,以NKG2D上升幅度更为显著,NKG2D/NKG2A 比值较正常组孕鼠增加;感染组蜕膜NK细胞内合成GranzymeA、GranzymeB、Perforin水平较正常组明显升高;感染组蜕膜NK细胞内IFN-y/IL-10比值也较正常组上升。为进一步探索弓形虫感染所致以上NK细胞功能分子的改变是否由Tim-3表达水平下降所致,本研究检测了 Tim-3-/-感染组中以上各功能分子的表达水平。结果显示,相比野生感染组孕鼠,Tim-3-/-感染组NKG2D表达水平明显上调,NKG2A表达水平也有一定上升,NKG2D/NKG2A比值较感染组明显增大;Tim-3-/-感染组蜕膜NK细胞内合成GranzymeA、GranzymeB、Perforin水平明显上调;IFN-y/IL-10比值较感染组明显上调。结论:孕期弓形虫感染可下调蜕膜NK细胞表面Tim-3的表达,进而导致蜕膜NK细胞活化性受体与抑制性受体平衡失调,并提高PI3K-AKT信号通路关键分子磷酸化水平,进而促进NK细胞内GranzymeB及IFN-γ表达的增加;通过Jak-Stat信号通路中pStat3的表达上调进一步促进蜕膜NK细胞IL-10的合成增加;pStat1的上调增加NK细胞Perforin的合成;使得蜕膜NK细胞杀伤活性增强,母胎耐受能力减弱,是孕期弓形虫感染致不良妊娠结局发生的重要分子机制。本项研究证实蜕膜NK细胞表面Tim-3在孕期弓形虫感染致不良妊娠结局中发挥重要作用,为全面阐明孕期弓形虫感染致不良妊娠结局的分子机制增添了新的内容,为今后建立有效治疗先天性弓形虫病的手段和方法奠定理论基础。