研究背景：脊髓是中枢神经系统的重要组成部分,脊髓损伤(Spinal cord injury, SCI)后几乎无再生能力,导致肢体运动、感觉功能丧失,甚至死亡；SCI对患者生活及社会影响巨大,近年干细胞及组织工程(Tissue Engineering, TE)治疗SCI取得一些进展是目前一个研究热点,但仍然没有有效的治疗方法满足临床需要。通常,自然无干预情况下,损伤脊髓经历了原发损伤和继发损伤的病理过程：①脊髓神经元死亡,凋亡和缺乏修复能力；②促进修复的因素如神经营养因子缺乏,微环境的变化；③中枢神经生长抑制因子的存在；④引导系统退化导致轴突不能沿正确方向生长：⑤损伤部位增殖的成纤维细胞、星型胶质细胞、小胶质细胞和上皮细胞形成神经胶质瘢痕,阻碍脊髓再生。而原发损伤细胞裂解释放的毒素又可导致继发损伤平面上下两侧的脊髓组织。鉴于SCI病理的复杂性,治疗策略应包括多个因素,联合应用多种治疗措施,不仅保护残存的神经元存活,而且能调节损伤脊髓的微环境,促进轴突再生,重建神经反射环路。SCI目前的治疗原理包括：①补充神经营养因子促进轴突存活与再生；②中和中枢神经生长抑制因子；③减少受损细胞变性和损失；④细胞移植补充受损细胞；⑤减少瘢痕和空洞,提供轴突生长的基质。到目前为止,SCI的动物实验尚没有满足临床治疗效果的有效对策。其中主要原因之一是由于传统的自体移植、同种异体移植或不同的合成支架移植都存在多方面的缺陷,例如：细胞来源受限、细胞功能改造、存在伦理学问题、免疫排斥反应、更重要的是人工支架不能模仿靶组织中细胞外基质(Extracellular matrix, ECM)三维结构等。更何况再生神经轴突通过支架时,容易出现弥散性生长而迷失生长方向。如何才能克服这些神经再生的不利因素呢?利用TE技术(即应用细胞、支架和生长因子,以多元联合移植的方式修复和重建受损组织)可能可以帮助损伤脊髓恢复功能,重建结构。近年的基础和临床研究也证实TE技术可以有效地帮助组织功能恢复及结构重建。以种子细胞复合生物支架移植为代表的脊髓修复研究的进展成为有潜力的SCI修复策略。其中,干细胞复合支架移植是其中研究的热点,干细胞是具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞,是形成生命机体各种组织器官的起源细胞。在不同微环境中能够自我更新及分化或横向分化为不同类型衍生细胞,可以用来替代病变或衰老的细胞。通常,干细胞分为胚胎干细胞(Embryonic stem cell, ESC)和成体干细胞。后者可来自骨髓、外周血、脐血(Cord blood, CB)等,它们具有神经细胞分化潜能并能分泌生长因子,促使受损神经轴突再生通过脊髓内空洞损伤区,并为之提供细胞迁移所必须的有益微环境或替代受损细胞。其中具有潜力的细胞之一脐血间充质干细胞(Cord blood mesenchymal stem cells, CB-MSCs)相比较其他来源的间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MS Cs)具有以下明显的优点：①来源丰富,易于获得；②采集方便,对供者无任何痛苦；③CB中免疫系统处于原始阶段,移植后急、慢性移植物抗宿主反应(Graft-versus-host reaction, GVHR)发生率及严重程度均轻；④CB中存在较原始的造血干细胞、MSCs以及内皮干／祖细胞等,具有更强的增殖、分化能力；⑤CB中各种病毒感染机会相对少。支架是TE技术另一个主要方面,理想的支架应具有多方面有益特性：仿生三维空间结构和彼此连通的孔隙网络,与靶组织相类似的生物力学性能,良好的生物学相容性以及对细胞因子传输功能等；以促进和引导细胞与组织的再生。近期才有报道的脱细胞脊髓(Acellular Spinal Cord, ASC)支架具备高度仿生特点,相比各种人工支架更复合脊髓组织特点。有潜力作为脊髓修复支架：桥接脊髓两侧残端、促进宿主神经细胞再生、抑制胶质瘫痕形成；能引导植入种子细胞的增殖、定向分化和迁移；引导神经轴突定向延伸、以重建脊髓神经环路、最终促进脊髓神经功能的修复。尚没有关于高度仿生的ASC支架体内修复SCI的报道。我们这项研究利用仿生的大鼠ASC支架复合人脐血间充质干细胞(Human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells, hUCB-MSCs)异种移植修复大鼠SCI缺损,观察疗效,并通过组织学,凋亡,局部免疫状况探讨机制,为将来SCI临床治疗提供基础和依据。目的：1.制备大鼠支架,观测脊髓内基质骨架的结构特点；体外分离人脐血间充质干细胞及扩增鉴定。2.探索大鼠脱细胞脊髓支架复合人脐血间充质干细胞促进脊髓损伤长节段轴突长入再生及功能恢复的效果,探讨其机制。3.探索大鼠脱细胞脊髓支架复合人脐血间充质干细胞修复脊髓半切缺损相关局部免疫调节及凋亡研究,从凋亡及局部免疫状况角度探讨相关机制。第一部分大鼠脊髓脱细胞支架促进大鼠半切脊髓缺损功能恢复目的：评价通过冻融萃取法获得高度仿生的大鼠ASC支架是否具有促进大鼠SCI运动功能恢复,以及其促进SCI功能恢复与宿主自体神经细胞迁移粘附,增殖分化的关系。方法：通过冻融萃取法获得高度仿生的ASC支架,观察大体,组织结构及超微结构；随机选取12只SD大鼠制作脊髓右半切缺损模型,随机分配到两个实验组：A组,SCI组(n=6)；B组,SCI+ASC支架组(n=6)。术后每周运用Basso, Beattie, and Bresnahan locomotor test (BBB)评分进行运动功能评价。分别于术后2周及8周进行标本神经细胞免疫荧光染色(Immunofluorescencestaining,IFS)和髓鞘碱性蛋白(Myelin basic protein,MBP)染色。两组术后右下肢功能学BBB评分采用SPSS20.0统计软件进行统计学分析,比较两组计量分析行Students’t检验,检验水准α=0.05,P<0.05表示有统计学差异。结果：ASC支架大体观呈乳白色,缺乏韧性,柔软；横截面为ECM构成的网络结构,充满空隙,表现为均一,平行排列的淡红色纤维结构；大多数的细胞,髓鞘和轴突从ASC支架上去除；截面具有三维网络结构；HE(Hematoxylin and eosin)染色观察：SCI组,显示脊髓右半切缺损模型完全破坏毁损脊髓背侧和腹侧右侧部分；SCI+ASC支架移植组：大鼠ASC支架非常好的整合入大鼠脊髓半切缺损,可见大量细胞核分布在ASC支架上；大鼠右后肢运动功能学：SCI+ASC支架移植组显著促进大鼠脊髓损伤后运动功能的恢复(P<0.05):IFS观察：几乎没有星型胶质细胞可以在支架上观察到；有少量神经元细胞和神经干细胞分布在支架上；而ASC支架植入物的主要分布神经细胞类型是少突胶质细胞,另外,MBP免疫组化示术后8周观察到髓鞘化轴突长入支架。结论：大鼠脱细胞脊髓支架是非常具有潜力修复脊髓损伤的材料,该支架通过改造局部微环境促进宿主少突胶质细胞增殖并促进轴突再髓鞘化。第二部分脊髓脱细胞支架复合人脐血间充质干细胞促进脊髓损伤长节段轴突长入再生及功能恢复目的：近年来通过干细胞治疗SCI取得了一些进展。而最近,具有脊髓修复潜力高度仿生天然脊髓组织ECM的ASC支架已经成功制备。本研究旨在探讨脊髓半切缺损损伤的是否可以通过植入高度仿生的ASC支架,及ASC支架复合hUCB-MSCs种子细胞获得功能改善及相关神经组织细胞形态学变化。方法：建立成年SD大鼠(n=36)SCI右半切损伤缺损模型,术后各组(A组：SCI+ASC支架、(n=12)；B组,SCI+ASC+hUCB-MSCs、(n=12)；C组：SCI、(n=12))分别立即植入仿生植入物。术后在每周各组进行大鼠行为学BBB评分测试,共8周。术后第二周及第八周进行神经细胞标志物免疫荧光检测,并在第八周完成生物素葡聚糖胺(biotinylated dextran amine,BDA)示踪切片检查。采用单因素方差分析(One-way ANOVA)检验各组大鼠行为学BBB评分统计差异,方差齐性后各组两两比较采用Bonferroni’s进行比较,以a=0.05为检验标准,P<0.05表示有统计学差异。结果：第三代hUCB-MSCs流式细胞仪(Flow cytometry,FCM)鉴定结果：该细胞低表达CD14(0.31%).CD34(0.82%).CD45(0.23%).HLA-DR(0.26%),并高表达以下粘附分子CD90(99.99%).CD29(92.95%).CD44(99.98%).CD105(99.92%)和CD73(99.88%),鉴定结果与MSCs的免疫表型相关报道一致。hUCB-MSCs复合ASC支架体外培养两天后大体观白色,柔软；5-溴脱氧尿苷(5-bromodeoxyuridine, BRDU)标记阳性的hUCB-MSCs分布在ASC支架ECM构成的三维网络结构内。术后大鼠行为学BBB评分各植入物组相比无植入组具有显著的运动功能改善(P<0.01)。行为学BBB评分两植入组(A组：SCI+ASC支架；B组,SCI+ASC+hUCB-MSCs)之间除第三周(P<0.05)外,其余个时间点无显著性差异(P>0.05)。BRDU标记阳性的hUCB-MSCs在植入后2周尚可观察到,但未观察发现其向神经细胞分化。此外,两植入组(A组：SCI+ASC支架；B组,SCI+ASC+hUCB-MSCs)植入物内见大量宿主神经细胞(主要是少突胶质细胞)。BDA追踪试验表明,有再生的宿主轴突生长入植入物,作为一个直接证据证明轴突再生的效果。扫描电镜(Scanning electron microscopy,SEM)观察两移植物组(A组：SCI+ASC支架；B组,SCI+ASC+hUCB-MSCs)移植物内存在较厚的髓鞘及有髓神经纤维。结论：我们的研究首次提供了实验证据表明,大鼠脱细胞脊髓支架与人脐血间充质干细胞能够促进大鼠脊髓损伤轴突再生和功能恢复。第三部分大鼠脊髓脱细胞支架复合人脐血间充质干细胞修复脊髓半切缺损相关局部免疫调节及凋亡研究目的：制作大鼠脊髓半切模型,观察ASC支架及其联合hUCB-MSCs移植修复SCI早期,对宿主免疫细胞损伤脊髓局部分布及凋亡的影响,探讨移植物恢复脊髓功能的机制。方法：按照前两部分法制作ASC支架,及分离培养hUCB-MSCs:取成年SD大鼠36只,随机分组：A组：SCI(n=12)；B组：SCI+ASC支架(n=12)；C组：SCI+ASC+hUCB-MSCs(n=12)；大鼠行脊髓半切缺损模型后分别植入相应组别植入物,于术后两周每组随机各取6只动物取材做免疫细胞标志物IFS及Tunel阳性细胞检测,高倍镜下计数阳性细胞数量；另每组各取6只动物取材行caspase-3活化度检测,计数OD(Optical Density)值。采用单因素方差分析(One-way ANOVA)检验各组阳性细胞数及caspase-3活化OD值的统计差异,方差齐性后各组两两比较采用Bonferroni’s进行比较,以a=0.05为检验标准,P<0.05表示有统计学差异。结果：C组(SCI+ASC+hUCB-MSCs)早期术后两周,明显抑制Tunel阳性细胞数(P<0.05)及caSpase3活化度(P<0.05),抑制凋亡；而B组(SCI+ASC)并无抑制凋亡作用。C组(SCI+ASC+hUCB-MSCs)植入脊髓损伤后两周明显抑制中性粒细胞(P<0.05)、巨噬细胞(小胶质细胞)(P<0.05)、T淋巴细胞(P<0.05)在脊髓损伤区趋化,增殖；而B组(SCI+ASC)未引发明显的免疫细胞局部分布差异,与A组(SCI)相比较,局部炎症细胞阳性细胞数量无明显差异(P>0.05)。C组(SCI+ASC+hUCB-MSCs)相比较其他两组早期对于1gM阳性表达无明显差异(P>0.05)。结论：大鼠脱细胞脊髓支架复合人脐血间充质干细胞修复脊髓半切缺损早期通过抑制凋亡,调节抑制局部免疫细胞趋化、增殖、促进脊髓功能恢复。