论文部分内容阅读
蓝藻(蓝细菌)是一类古老的具有放氧光合作用的革兰氏阴性细菌,在漫长的自然选择过程中进化出独特的环境适应能力,广泛分布于不同的生境中。由于水体的富营养化,蓝藻常常爆发形成水华,甚至释放毒素,成为世界性的环境问题,引起公众的关注。对磷极高的生物利用率是蓝藻获得生态竞争优势、导致蓝藻水华发生的关键因素。虽然富营养化水体中磷源非常丰富,但蓝藻等微生物能直接利用的无机磷却很缺乏。因此,阐明蓝藻细胞利用不同形式磷源的代谢调控,对揭示蓝藻水华发生的分子机制、监测蓝藻水华发生具有重要的意义。鱼腥藻(Anabaena sp.)FACHB 709是来源于淡水湖泊(中国,武汉东湖)的一种丝状固氮蓝藻。该藻与模式生物鱼腥藻(Anabaena sp.)PCC 7120高度同源,具有遗传操作系统,可通过接合转移将重组基因导入细胞。本论文利用微生物学、生物信息学、生物化学和分子生物学技术,研究了不同磷源对鱼腥藻FACHB 709生长的影响、发现并鉴定了在藻细胞的磷代谢调控过程中具有关键作用的碱性磷酸酶基因,并通过分析多个碱性磷酸酶基因对不同磷源的表达调控及其生理功能,以期揭示鱼腥藻FACHB 709碱性磷酸酶基因在磷代谢调控中的作用机制。本论文包括以下主要研究内容和结果：(1)研究了不同种类、不同浓度磷源对鱼腥藻FACHB 709生长和碱性磷酸酶活性的影响,结果表明磷缺乏诱导藻细胞生长抑制而不是死亡；鱼腥藻细胞通过上调碱性磷酸酶活性应对磷饥饿。磷饥饿细胞在无机磷不存在的条件下,能利用有机磷G-6-P和pNPP获得部分生长。同时,有机磷的利用可在一定程度上导致细胞总碱性磷酸酶活性下降。(2)分析鱼腥藻FACHB 709和其它几种蓝藻的亲缘关系,发现鱼腥藻FACHB709是鱼腥藻PCC 7120和产水华蓝藻—多变鱼腥藻(Anabaena variabilis)ATCC29413的近源种。利用近缘种中公认的碱性磷酸酶基因序列,扩增并克隆了鱼腥藻FACHB 709中可能的碱性磷酸酶基因,对克隆的全基因DNA片段测序和分析,发现鱼腥藻FACHB 709中存在四个碱性磷酸酶基因,分别为phoA-709、phoDl-709、phoD2-709和phoS-709.(3)构建了鱼腥藻FACHB 709碱性磷酸酶基因启动子和β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的转录融合重组质粒,并将重组质粒接合转移到鱼腥藻FACHB 709,通过测定所得鱼腥藻调控报告菌株的β-半乳糖苷酶活性,分析四个碱性磷酸酶基因在不同浓度无机磷存在条件下的表达调控。结果表明,无机磷充足条件下,除了phoD2-709没有转录活性外,其余三个碱性磷酸酶编码基因phoA-709、phoD1-709和phoS-709都有转录活性；无机磷缺乏条件下,四个碱性磷酸酶基因通过上调转录水平,参与鱼腥藻FACHB 709的磷代谢调控反应,其中以phoA-709的作用最为显著。(4)利用免疫学方法,研究了鱼腥藻FACHB 709中四个碱性磷酸酶基因在蛋白水平的表达和分布。结果显示无机磷缺乏条件下,四个碱性磷酸酶基因的表达水平全部升高,且它们的表达产物分泌到了细胞外培养基中。(5)构建碱性磷酸酶基因缺失突变株DRTH65 (敲除phoA-709)和DRTH61(敲除phoS-709),检查突变株的生长和生理表型,结果表明在实验条件下,突变株DRTH65和DRTH61的生长和碱性磷酸酶活性与野生型鱼腥藻的没有差异。通过分析单个碱性磷酸酶基因缺失后,其余APase基因的表达调控,发现在含磷和缺磷条件下,phoD1-709和phoS-709转录水平的上调一定程度上可弥补phoA-709的失活；而phoD1-709和phoA-709转录水平的上调则一定程度上弥补了phoS-709的失活。本论文得到以下主要结论：(1)无机磷是鱼腥藻FACHB 709细胞吸收和利用的主要磷源形式和关键生长因子；藻细胞通过调控碱性磷酸酶活性应对无机磷饥饿诱导的细胞生长抑制。(2)鱼腥藻FACHB 709是鱼腥藻PCC 7120的近缘种,并且具有与之相同的碱性磷酸酶基因组成和序列高度同源的碱性磷酸酶PhoA-709、PhoD1-709、PhoD2-709和PhoS-709.(3)磷饥饿诱导鱼腥藻FACHB 709中四个碱性磷酸酶基因phoA-709、phoD1-709、phoD2-709和phoS-709转录水平和翻译水平的上调,但转录水平上调的程度存在差异。其中,phoA-709在藻细胞磷源代谢调控中具有关键作用。(4)鱼腥藻FACHB 709中四个碱性磷酸酶PhoA-709、PhoD1-709、PhoD2-709和PhoS-709都是分泌型蛋白,缺磷诱导后分泌到细胞外培养基中。(5)phoA-709和phoS-709在鱼腥藻FACHB 709细胞磷代谢中具有重要作用但并非必需基因；phoA-709、phoD1-709和phoS-709编码的碱性磷酸酶可能在功能上重叠或互补。