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本研究利用新一代测序技术(RNA-seq)构建非洲菊舌状花转录组,并以转录组为参考数据库,再以RNA-seq技术构建赤霉素处理早期舌状花的表达谱,综合分析差异性表达基因,探寻赤霉素参与细胞分裂的分子机制。
在这项研究中,利用Illumina高通量测序平台对非洲菊舌状花各期RNA的混样进行测序。去除无效读长后,总共得到72,688,546个reads,计5,900,537,520 nt。经过Trinity软件组装,获得47,104个UniGene,平均长度为845 nt,N50为1321nt。去除污染序列后,一共有46,881条转录本属于非洲菊的基因,用NCBI蛋白质数据库(Nr),NCBI非冗余核苷酸数据库(Nr),基因本体论(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库做参考,共注释37,389条转录本。
为探讨赤霉素在非洲菊舌状花发育过程中的作用,根据转录组信息,筛选出与赤霉素代谢和信号转导相关的基因,以及参与其他植物激素信号转导的基因。RT-PCR和Realtime RT-PCR的结果显示,参与细胞分裂的CYCLI家族基因在非洲菊1期的舌状花强烈表达。结合本实验室已有的赤霉素促进舌状花生长的研究结果,提示可以利用幼嫩非洲菊头状花序上的舌状花研究赤霉素在促进花发育,尤其是细胞分裂中的作用。
离体花序培养结果显示,10μM GA3处理能使1期及更幼嫩花序继续生长至半开放,但1期之前的花序生长相对不一致,且取材困难。因此,选用GA处理的1期舌状花构建表达谱,以错误发现率(False Discovery Rate,FDR)≤0.001和|log2 PRKM(2h)/PRKM(0 h)|≥1为筛选条件,共发现差异性表达基因490条,其中上调基因234条,下调基因256条。显然,这些差异性表达基因对赤霉素处理后的反应是一个整体调控网络。为获得这些差异性表达基因在细胞生长中的功能,我们对KEGG的多条通路进行综合分析,发现赤霉素处理2h后,不仅导致了核苷酸合成及DNA复制和修复通路的关键性基因的上调,还引起了参与细胞结构基因的改变,诱发了热休克反应。这些结果暗示,GA处理促进碱基和DNA的合成,同时利用激素诱发ROS反应改变细胞壁结构,诱发了热休克因子,促进了细胞分裂。进一步采用羟基脲预培养花序,将细胞同步化在G1期,Real-time RT-PCR验证结果发现,编码CYCLIN周期蛋白(CYCD3;1,CYCA和CYCB)的基因在处理组和对照组中均表现出明显的周期性表达,且处理组的峰值明显较对照组提前2~4 h。我们推测GA促进CYCLI家族的表达,增加细胞对CYCLIN蛋白的敏感性,缩短细胞周期,加快细胞分裂的速度,促进离体花序和花瓣的生长,导致花瓣的开放。根据上述的研究结果,我们初步构建了GA促进非洲菊早期舌状花细胞生长的调控网络。