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基因组印记是基本的生物学现象,通过印记决定来自特定亲本的基因表达,而另一亲本基因不表达,从而保证了个体发育中两个亲本基因组的必需性,是有性生殖的重要保证。在哺乳动物中,约有数百个基因受到印记的调控。印记基因的表达模式建立于生殖细胞分化时期,并在受精的过程中重新组合。正确的印记模式对动物的发育至关重要,并受到严格的调控。印记模式的紊乱往往会导致胚胎发育异常、妊娠终止或产生各种类型的疾病。 多能性干细胞具有广泛的发育潜能,能够分化成所有类型的成体细胞,在再生医学和药物研究的领域具有广阔前景。另一方面,多能性干细胞可以作为同源重组和基因编辑的载体,并通过种系嵌合得到遗传修饰的动物,从而在细胞和个体层面解析DNA序列的功能。研究显示,印记基因的调控对于多能性干细胞的发育能力至关重要,其紊乱往往会导致多能性干细胞发育能力丧失或异常。然而在多能性干细胞的获得、建立和维持过程中,常常发生印记丢失的现象,对多能性干细胞的应用带来巨大风险。本论文主要针对多能性干细胞中的印记调控展开研究,探索快速展现多能性干细胞的印记状态的新方法,通过印记状态筛选具有更好多能性水平的干细胞系,以及通过印记的遗传学修饰改变多能性干细胞的发育能力。 首先,针对通过体细胞重编程获得多能性干细胞过程中常常出现的印记紊乱现象,我们探索了建立能够体现印记状态的印记基因报告体系,并利用此体系快速筛选具有更好发育能力的诱导多能性干细胞系。我们通过同源重组的方式,获得了Gtl2-GFP定点整合的小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cell,mouse EScell)系。诱导多能性干细胞(induced pluripotent stem cell,iPS cell)是经成体细胞体外诱导而来的多能性干细胞,它避免了获取ES细胞的伦理争议,具有更好的免疫相容性,是重编程和再生医学领域的重大成就。诱导iPS细胞的过程中,一个重要的印记区域Dlk1-Dio3可能发生异常沉默,限制了iPS细胞发育能力,无法获得完全的多能性。本研究建立的Gtl2-GFP报告体系,能指示Dlk1-Dio3印记区域表达情况,进而指示iPS细胞的多能性水平,获取高质量的iPS细胞。 其次,我们以孤雌单倍体胚胎干细胞(parthenogenetic haploid embryonic stemcell,phES cell)为载体,研究了两个主要印记区域对于哺乳动物孤雌胚胎发育能力的影响。单倍体胚胎干细胞(haploid embryonic stem cell,hES cell)是同时具备多能性和单倍性的ES细胞,来源于激活的单倍体胚胎。phES细胞能够替代雌原核,和精子组成重构胚胎,并发育成完整的个体。我们进一步研究了phES细胞和卵子构成的孤雌重构胚胎的发育能力。通过修饰两个重要的印记区域的调控区,phES细胞能和卵子组成具有正常发育能力的孤雌胚胎。该研究首次实现了来源于成熟卵细胞的哺乳动物孤雌生殖,拓展了哺乳动物单性生殖的技术路线,为小鼠的印记研究提供了新的平台。 综上,我们的研究建立了印记基因示踪和功能研究的新方法,通过印记基因报告体系实现了快速筛选具有更高多能性水平的干细胞系,并通过印记修饰获得孤雌来源的小鼠,揭示了不同印记状态在个体发育中的功能,从而为干细胞的研究和应用提供了新基础,为生殖生物学研究带来了新思路。