论文部分内容阅读
猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRS Virus,PRRSV）引起的一种全球性的猪的病毒性传染病,主要以母猪繁殖障碍及仔猪严重的呼吸道疾病为主要特征。根据其抗原性和病毒基因组的差异,将PRRSV分为2个基因型:Type 1 PRRSV（欧洲型,EU）和Type2 PRRSV（北美型,NA）,两者之间的核苷酸同源性仅为50%70%。PRRS于1996年开始在国内出现并流行,成为危害我国养猪业最严重的疾病之一。2006年国内暴发的高致病性PRRS（Highly Pathogenic PRRS,HP-PRRS）给中国的养猪业造成了巨大的经济损失,2013年左右我国出现了引起妊娠母猪严重流产和仔猪呼吸系统疾病的新流行毒株NADC30-like PRRSV。近年来Type 1 PRRSV在我国部分省市流行,进一步加大了对PRRS的防控难度。福建省是中国的养猪大省,养猪业是当地重要的经济支柱,因此有必要对福建省的PRRSV的流行情况、基因变异、基因组特性及病毒重组情况等进行实时调查,初步掌握福建省PRRSV变异规律,为科学防控PRRS提供理论基础。2013年出现的NADC30-like PRRSV给猪场造成严重的经济损失,该类毒株的生物学特性、致病性及疫苗Ingelvac PRRS MLV（MLV）能否对其起到免疫保护目前还不清楚,因此有必要开展该类毒株的相关研究。基因重组是PRRSV进化的重要机制之一,在PRRSV复制、调节毒力、致病性及免疫逃避中发挥着重要的作用,本研究对分离到的来源于lineage 8.7和lineage 1（NADC30-like PRRSV）两个谱系的新型重组病毒进行了基因组分析以及致病性研究。主要内容包括:1.20092016年福建省PRRSV分子流行病学调查应用RT-PCR方法,对福建省龙岩市、漳州市、厦门市、福州市、三明市、莆田市和宁德市等七市的102个不同规模的猪场开展了PRRSV病原学调查。结果表明福建省同时存在Type 1 PRRSV和Type 2 PRRSV,以Type 2 PRRSV流行为主。基于ORF5基因的系统进化分析表明（Shi et al.,2010b）,福建省Type 2 PRRSV可分为lineage 1、lineage 3、lineage 5.1和lineage 8.7四个谱系,其中lineage 1（NADC30-like PRRSV）和lineage 3是福建省新出现的毒株。20092013年福建省以lineage 8.7的毒株为主,20142016年流行毒株发生了转变,以NADC30-like PRRSV为主。PRRSV GP5中和表位发生较高程度的变异,N-糖基化位点增多并逐步靠近下游的中和表位。选取14株不同年份不同谱系的Type 2 PRRSV（1株lineage 3、5株lineage 8.7、1株lineage 5.1和7株lineage 1）和2株Type 1 PRRSV进行病毒的分离及全基因组扩增。结果表明福建省14株Type 2 PRRSV与VR-2332、CH-1a、JXA1和NADC30的基因组核苷酸同源性为82.9%99.4%,福建省14株PRRSV之间基因组核苷酸同源性为82.1%99.3%。20132016年分离的5株NADC30-like PRRSV与NADC30的核苷酸同源性呈现逐年降低的趋势,而与国内HP-PRRSV代表毒株JXA1、HuN4、TJ、JX143、NT1、NT2、NT3和经典毒株CH-1a的核苷酸同源性呈上升趋势。分离株FJCH、FJZH与JXA1-R疫苗株高度同源（99.5%99.6%）且处于同一进化分支,推测可能来源于疫苗株。基因重组分析表明14株Type 2 PRRSV存在较高的重组概率（3/14）,均发生在lineage 8.7和lineage 1之间。基于ORF7核苷酸序列构建的进化树显示,两株Type1 PRRSV（FJEU13和FJQEU14）属于泛欧1型,但处于两个不同的进化分支。此外,两株毒株全基因组核苷酸同源性仅为82.9%,表明两株毒株来源于不同的祖先。2.NADC30-like PRRSV FJZ03株的致病性及免疫保护性研究将NADC30-like PRRSV FJZ03毒株和HP-PRRSV FJLYDX毒株分别接种30日龄PRRSV和PCV2阴性仔猪,观察、记录和对比各试验组感染猪的临床症状、体温变化、体外排毒情况、病毒血症及组织病变等情况。试验结果显示,FJZ03株能在猪体内快速复制,引起仔猪较高滴度的病毒血症,体温升高和体外排毒时间均早于高致病性毒株FJLYDX,并且引起严重的间质性肺炎和脾脏萎缩,表明FJZ03对仔猪具有较强的致病性。免疫保护性试验结果表明,与FJZ03攻毒组相比,疫苗免疫组的仔猪在接种FJZ03后虽然临床症状有所减轻,且发热天数减少,但是仔猪血液中仍含有较高的病毒血症,攻毒后14天仍能达到103.8 TCID50/mL,并能引起与FJZ03攻毒组相似的间质性肺炎。同时疫苗免疫后不能有效的诱导机体产生针对FJZ03的中和抗体,表明MLV疫苗不能对猪只提供完全的免疫保护。3.HP-PRRSV和NADC30-like PRRSV新型重组毒株的鉴定及致病性分析14LY01-FJ、14LY02-FJ、15LY01-FJ和15LY02-FJ四株分离株分别于2014年12月2015年4月从四个不同地区的高发病率（100%）和高死亡率（4080%）的猪场分离到的。为了进一步了解这些新型病毒株的特性,对四株分离株进行了全基因组序列分析和致病性研究。序列分析表明四个毒株均为Type 2 PRRSV,四个毒株基因组除去poly（A）后全长为15017 bp或15018 bp。与VR2332相比,四个毒株在Nsp2的高变区II存在131 aa的不连续缺失（aa322432、aa483和aa504522）,缺失模式与MN184、NADC30毒株相同。系统发育进化树和重组分析表明四个毒株均来源于JXA1-like PRRSV（lineage 8.7）和NADC30-like PRRSV（lineage 1）之间的自然重组。动物试验结果表明四株分离株在仔猪体内能快速复制,引起仔猪严重的间质性肺炎和较高的死亡率（40%80%）,和HP-PRRSV类似,表明四株分离株为高致病性毒株。鉴于新毒株不间断的出现,因此有必要加强对PRRSV的监控,采取有效的措施控制PRRS的流行。4.HP-PRRSV疫苗株和NADC30-like PRRSV重组病毒的鉴定及致病性研究本研究自2012年连续4年跟踪调查某规模化猪场PRRSV的流行动态。该猪场通过接种低剂量JXA1-R疫苗,保持整个猪场为PRRS阳性稳定场。每年定期按照群体10%的比例采血进行PRRSV Nsp2、ORF5和ORF7抗原和抗体检测,同时进行PRRSV的分离,结果表明该猪场只存在疫苗毒株且没有发现疫苗株毒力返强的现象。2015年12月该猪场突然发病,发病猪只表现高热（40°C42°C）,发病率为45%,死亡率为40%左右,经实验室检测确定病原为PRRSV。系统发育进化树和重组分析表明分离毒株FJXS15在ORF1a（nt 901-）ORF4（-nt 419）区域与JXA1-R疫苗株高度同源,在5’-UTR、ORF5aORF7和3’-UTR与NADC30-like PRRSV FJZ03高度同源,并在ORF1a（nt 1092）和ORF4（nt 13770）处存在两个可靠的重组断裂点,推测分离毒株FJXS15由JXA1-R疫苗株和FJZ03重组而来。动物试验证实,FJXS15组仔猪比其亲本毒株FJZ03组和JXA1-R疫苗株组表现更严重的临床症状,持续的高热（>40.3°C）和严重肺损伤,仔猪死亡率为25%,而其它组仔猪均未发生死亡,表明基因组重组在病毒进化和调节毒力中发挥重要的作用。鉴于疫苗株和NADC30-like PRRSV存在重组现象,因此猪场不能单纯依靠疫苗防控PRRS,应采取综合防治措施,尤其要加强猪场的生物安全。