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水稻干物质产量的90％～95%来自于光合作用,叶片是植物进行光合作用的主要场所,它的发育将直接影响植物的生长发育。因此,分离与鉴定各种叶发育突变体并且克隆相关基因有助于揭示水稻叶发育的分子机制,研究叶发育相关基因的表达调控将为它们参与水稻叶形态发育提供直接证据。
本研究以粳稻品种中花11(ZH11)及由于T-DNA插入引起的卷叶等多种表型变化的突变体IL39为材料,利用RACE技术克隆候选基因r186(t)的全长cDNA;利用Q-PCR对r18(t)基因进行了表达分析;利用生物信息学技术对r18(t)基因的序列及其5和3进行了序列分析;通过构建载体pr18(t)-X1和pr18(t)-X2初步探讨了水稻基因r18(t)表达负调控元件的位置,为分析调控分子以哪种途径或方式调控r18(t)基因奠定了基础。本研究获得的主要结果如下:
(1)通过5和3RACE的方法获得了r18(t)基因完整cDNA,结果表明r18(t)基因的cDNA全长842bp,由2个外显子组而成。两个外显子的长度分别为77bp和765bp,内含子长度为162bp。经基因预测可知该基因+111到+497为编码蛋白质区域,其蛋白质具有129个氨基酸。
(2)Q-PCR的结果表明,r18(t)基因在野生型材料ZH11中不表达,而在T-DNA插入突变纯合体IL39Hm整个植株各器官中都有不同程度的表达,其中花序的表达水平最为强烈,其次为叶、叶鞘、茎,根部表达最弱。
(3)对r18(t)基因3端的3000bp的碱基进行调控元件分析得知,此区域内存在一个miRNA结合位点Osa-miR809h,位于r18(t)基因的第2外显子末端561bp处,预测其通过形成茎环结构从而导致基因的负调控。此外,在距离r18(t)基因的第2外显子末端3579bp处,存在一个Athb-1转录因子结合位点。
(4)根据对r18(t)基因3端分析结果,用包含了miRNA结合位点的X1区域(6.3kb)和包含了Athb-1结合位点的X2区域(8.2kb)分别与载体pCAMBIA1301相连构建了pr18(t)-X1载体和pr18(t)-X2载体,遗传转化ZH11,获得pr18(t)-X1转基因阳性植株,植株出现卷叶性状,且r18(t)基因的表达水平与其在野生型ZH11中相比,表达水平增强。从而排除了是miRNA分子参与调控水稻r18(t)基因的负调控表达,为下一步研究负表达调控元件及机制提供了参考。
总之,本研究利用RACE技术克隆了水稻r18(t)基因的全长cDNA:用Q-PCR分析了基因的表达模式;通过构建r18(t)基因的表达负调控元件验证载体对其进行了验证,初步揭示了该基因表达负调控机制,为进一步揭示水稻叶片发育的机制及完善水稻叶形态建成理论提供了证据。