研究背景:心脏间质纤维化是心肌梗死(MI)后病理性心脏重构的特征性病变,也是MI后心力衰竭发生的关键机制之一。然而,MI后心脏间质纤维化的细胞与分子机制尚未阐明,临床上也缺乏特别有效的治疗药物与干预手段。容积敏感性外向整流型氯离子通道(VSOR Cl~-channel)亦称为容积调节阴离子通道(VRAC),是哺乳动物细胞膜上广泛存在的阴离子通道,参与调节细胞体积变化、增殖与分化、细胞坏死与凋亡等多种细胞学过程。VSOR Cl~-通道与多种心血管系统疾病的发生发展密切相关,如心肌缺血/再灌注损伤、恶性心律失常及心肌肥厚等。新近研究表明,VSOR Cl~-通道的构成蛋白SWELL1可作为跨细胞膜的信号转导分子调节细胞内多种关键信号通路,在淋巴细胞发育与功能调控、神经递质释放和胰岛素抵抗等病理生理过程中发挥重要调节作用。然而,SWELL1是否影响MI后心脏间质纤维化?若能,其下游分子机制是什么?上述问题尚无明确回答。研究目的:(1)动态观察MI后心肌组织与心脏成纤维细胞SWELL1表达变化;(2)明确SWELL1是否影响MI后心脏间质纤维化进程;(3)明确SWELL1如何调节心脏成纤维细胞向肌成纤维细胞活化、增殖、胶原蛋白及促纤维化因子表达等影响心脏间质纤维化的细胞学过程;(4)探讨SWELL1影响心脏间质纤维化的下游分子机制。研究方法:(1)为动态观察MI后心肌组织SWELL1表达变化,我们将成年雄性C57BL6J小鼠分为假手术(Sham)组或MI手术组,分别在术后7 d、14 d、28 d分别测量梗死边缘区与远端区心肌组织SWELL1蛋白和mRNA表达水平。分离Sham或MI术后28 d的小鼠心脏成纤维细胞,测定SWELL1蛋白和mRNA表达水平。(2)为明确SWELL1是否影响MI后心脏间质纤维化,我们向成年雄性C57BL6J小鼠心脏点注射携带SWELL1 siRNA的纯化腺病毒(Ad-SWELL1 siRNA)或对照纯化腺病毒(Ad-Scramble)。点注射第7 d实现心脏特异性SWELL1敲低后,小鼠随机接受Sham或MI手术。术后28 d观察小鼠生存率,超声心动图评估心脏功能,马松三色法与天狼星红染色评估心脏间质纤维化程度,α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)免疫荧光染色与Western blot评估心脏成纤维细胞向肌成纤维细胞活化的程度,RT-PCR检测心肌组织中I型胶原蛋白、III型胶原蛋白以及促纤维化因子Fibronectin与结缔组织生长因子(CTGF)mRNA表达水平。(3)为明确SWELL1是否直接调控心脏成纤维细胞向肌成纤维细胞活化、增殖、胶原蛋白及促纤维化因子表达等影响心脏间质纤维化的细胞学过程,我们分离SD乳鼠原代心脏成纤维细胞,采用腺病毒转染siRNA方法敲低心脏成纤维细胞SWELL1表达,观察SWELL1敲低对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的心脏成纤维细胞向肌成纤维细胞活化、增殖、胶原蛋白及促纤维化因子表达等细胞学过程的影响,采用胶原凝胶收缩实验综合评估SWELL1敲低对心脏成纤维细胞促纤维化能力的影响。(4)为进一步明确SWELL1是否直接调控心脏成纤维细胞向肌成纤维细胞活化、增殖、胶原蛋白及促纤维化因子表达等影响心脏间质纤维化的细胞学过程,我们分离SD乳鼠原代心脏成纤维细胞,采用慢病毒转染的方法在心脏成纤维细胞中过表达SWELL1,观察SWELL1过表达对TGF-β1诱导的心脏成纤维细胞向肌成纤维细胞活化、增殖、胶原蛋白及促纤维化因子表达等细胞学过程的影响,采用胶原凝胶收缩实验综合评估SWELL1过表达对心脏成纤维细胞促纤维化能力的影响。(5)为筛选SWELL1调节心脏成纤维细胞促纤维化细胞学过程的下游分子机制,我们分离了SD乳鼠原代心脏成纤维细胞,采用腺病毒转染方式敲低SWELL1表达,提取细胞总RNA并进行高通量RNA-Seq试验。明确对照组与SWELL1敲低组心脏成纤维细胞之间的差异表达基因谱,并对两组间的差异表达基因进行GO和KEGG功能富集分析,筛选SWELL1可能影响的下游信号转导通路。(6)针对上一步筛选出的JAK2-STAT3信号通路,我们采用JAK2特异性抑制剂WP1066或STAT3特异性抑制剂Stattic分别处理SWELL1过表达的心脏成纤维细胞,观察阻断JAK2-STAT3信号通路对SWELL1调节的心脏成纤维细胞向肌成纤维细胞活化、增殖、胶原蛋白及促纤维化因子表达等细胞学过程的影响,利用胶原凝胶收缩实验评估阻断JAK2-STAT3信号通路对SWELL1过表达心脏成纤维细胞促纤维化能力的影响。验证JAK2-STAT3信号通路是否是SWELL1调节心脏间质纤维化的下游分子机制。研究结果:(1)与Sham组相比,MI组小鼠梗死边缘区心肌组织SWELL1的蛋白表达水平在MI后7 d、14 d显著增高(均P<0.05),在MI后28 d时回落至正常水平。梗死边缘区心肌组织SWELL1 mRNA的表达水平与蛋白水平表达趋势一致。与Sham组相比,MI组小鼠梗死远端区心肌组织SWELL1的蛋白表达水平在MI后7 d时无明显变化,在MI后14 d、28 d时较Sham组显著增高(均P<0.05)。梗死远端区心肌组织SWELL1 mRNA的表达水平与蛋白水平表达趋势一致。在MI后第28 d时,MI组小鼠原代心脏成纤维细胞SWELL1蛋白与mRNA水平较Sham组显著增高(均P<0.05)。(2)点注射Ad-Scramble或Ad-SWELL1 siRNA纯化腺病毒7 d后,Ad-SWELL1siRNA组左心室组织SWELL1蛋白与mRNA表达水平较Ad-Scramble组显著降低(均P<0.05)。Ad-SWELL1 siRNA心肌点注射降低了MI术后小鼠死亡率(76.6%vs 66.6%)。Ad-SWELL1 siRNA组小鼠在MI术后28 d时左心室射血分数(LVEF)更高(P<0.05),左心室舒张末期直径(LVEDD)与左心室收缩末期直径(LVESD)更小(均P<0.05)。马松三色法与天狼星红染色发现,Ad-SWELL1 siRNA组显著减少了MI后心脏间质纤维化面积与胶原纤维的沉积(均P<0.05)。Western blot与免疫荧光染色表明,Ad-SWELL1 siRNA组心肌组织中肌成纤维细胞特异性标记蛋白α-SMA表达显著减少(均P<0.05)。(3)腺病毒转染介导的SWELL1敲低显著降低了原代心脏成纤维细胞SWELL1蛋白表达水平(P<0.05)。Western blot和免疫荧光染色显示,SWELL1敲低显著抑制了TGF-β1诱导的心脏成纤维细胞α-SMA表达(均P<0.05)。SWELL1敲低显著抑制了TGF-β1诱导的心脏成纤维细胞增殖(P<0.05)。SWELL1敲低抑制了TGF-β1诱导的心脏成纤维细胞I型胶原蛋白、III型胶原蛋白以及Fibronectin与CTGF等促纤维化因子表达(均P<0.05)。胶原凝胶收缩实验表明,SWELL1敲低显著抑制了心脏成纤维细胞的促纤维化能力(P<0.05)。(4)慢病毒转染介导的SWELL1过表达显著上调了原代心脏成纤维细胞SWELL1蛋白表达水平(P<0.05)。Western blot和免疫荧光染色显示,SWELL1过表达显著上调了TGF-β1诱导的心脏成纤维细胞α-SMA表达水平(均P<0.05)。SWELL1过表达显著促进了TGF-β1诱导的心脏成纤维细胞增殖(P<0.05)。SWELL1过表达促进了TGF-β1诱导的心脏成纤维细胞I型胶原蛋白、III型胶原蛋白以及Fibronectin与CTGF等促纤维化因子表达(均P<0.05)。胶原凝胶收缩实验表明,SWELL1过表达显著增强了心脏成纤维细胞的促纤维化能力(P<0.05)。(5)RNA-Seq结果表明,SWELL1敲低组心脏成纤维细胞较对照组共有2087个差异表达基因。其中表达上调基因1025个,表达下调基因1062个。GO与KEGG功能富集分析发现,与对照组相比,SWELL1敲低组心脏成纤维细胞变化最明显的5个信号转导通路分别是:TNF signaling pathway、PI3K-Akt signaling pathway、JAK-STAT signaling pathway、IL-17 signaling pathway与MAPK signaling pathway。与心脏间质纤维化关系密切的JAK-STAT信号通路中,两组间共有37个差异表达基因。其中,表达上调的差异基因7个,表达下调的差异基因30个。30个表达下调的差异基因中,JAK2-STAT3信号通路成员及其下游分子Jak2、Socs3、Il6与Pim1表达均显著下调(均P<0.05)。我们采用RT-PCR进一步验证了SWELL1敲低显著降低心脏成纤维细胞Jak2、Socs3、Il6与Pim1 mRNA表达水平(均P<0.05)。(6)SWELL1敲低显著降低MI后心肌组织JAK2和p-STAT3(Tyr705)蛋白表达水平(均P<0.05),提示SWELL1敲低显著抑制了MI后心肌JAK2-STAT3信号通路。SWELL1过表达可显著上调了心脏成纤维细胞JAK2和p-STAT3(Tyr705)蛋白表达(均P<0.05),促进了TGF-β1诱导的心脏成纤维细胞向肌成纤维细胞活化、增殖、胶原蛋白与促纤维化因子表达,增强了心脏成纤维细胞促纤维化的能力(均P<0.05)。上述变化均可被JAK2特异性抑制剂WP-1066或STAT3特异性抑制剂Stattic阻断(均P<0.05)。研究结论:(1)我们在不同时间点动态地观察MI后心脏组织中SWELL1表达变化,发现在MI早期,心肌组织与心脏成纤维细胞SWELL1蛋白与mRNA表达呈时间依赖性上调,提示SWELL1可能参与调节MI后心脏间质纤维化进程。(2)本课题首次证实:SWELL1是一个重要的调控心脏间质纤维化的内源性信号分子。SWELL1敲低显著减轻了MI相关的心功能障碍与心脏间质纤维化,提示SWELL1可作为一个防治MI后心脏间质纤维化的新靶点。(3)本课题首次筛选出并证实JAK2-STAT3信号通路是SWELL1影响心脏成纤维细胞活化、增殖、胶原蛋白与促纤维化因子表达的下游关键分子机制。综上所述,本课题首次证实心脏SWELL1参与调节MI后心脏间质纤维化的进程。SWELL1表达上调是导致MI后心功能障碍与心脏间质纤维化的重要致病机制之一。另外,本课题还发现了SWELL1调节心脏成纤维细胞向肌成纤维细胞活化、增殖、胶原蛋白及促纤维化因子表达等细胞学过程依赖于下游的JAK2-STAT3信号通路。这些结果提示,干预心脏SWELL1及其下游JAK2-STAT3信号通路可望成为防治MI后心脏间质纤维化与心力衰竭的新策略。