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2—苯乙醇是一种重要的香气化合物,具有愉悦的果香,蜜香味。2—苯乙醇是威代尔葡萄特征性香气的重要来源。苯丙氨酸作为挥发性酚类物质的合成前体,是葡萄中具有玫瑰和丁香花香的2—苯乙醇的来源。芳香族氨基酸脱羧酶是2—苯乙醇合成途径中的第一步反应酶,也是代谢途径中的一个关键酶,可以通过调控该酶的基因表达来调控2—苯乙醇的合成。本文通过电子拼接,聚合酶链式反应等方法从葡萄果实中克隆到一条芳香族氨基酸脱羧酶的片段cDNA,并在此基础上探讨了芳香族氨基酸脱羧酶在威代尔葡萄果实成熟和后熟过程中的表达特性,为进一步研究葡萄果实中2—苯乙醇的代谢途径奠定了良好的实验和理论基础。
(1)采用聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)对葡萄芳香族氨基酸脱羧酶基因片段序列(832 bp)进行扩增,扩增产物直接连接到克隆载体pMD19-T,并转化大肠杆菌DH5α。经过蓝白斑筛选、小量提取质粒进行鉴定以及基因测序鉴定得到芳香族氨基酸脱羧酶基因片段。
(2)以成熟和后熟期的威代尔葡萄为材料,采用RT-PCR、HPLC、氨基酸自动分析仪等方法对芳香族氨基酸脱羧酶的表达特性及葡萄成熟和后熟期苯丙氨酸及苯乙胺变化规律进行了研究。RT-PCR的结果显示:AADC片段的转录本的量总体呈逐渐增加趋势;氨基酸自动分析仪检测结果显示:威代尔葡萄在成熟和后熟期,积累了大量的前体物苯丙氨酸;HPLC的检测结果显示:在成熟过程中苯乙胺的含量是不断增加的,进入后熟期后,在花后130天时含量达到最大0.0195mg/kg,之后迅速降低。虽与转录本的变化趋势不太相符,这只是2—苯乙醇代谢途径的第一步反应,苯乙胺可能于后熟期在其他酶的作用下快速转化为苯乙醛和苯乙醇。
(3)不饱和脂肪酸和多胺为逆境响应因子。威代尔葡萄在成熟过程中不饱和脂肪酸的含量在花后120天时含量达到最大,最大值为0.195mg/kg,之后含量逐渐降低。在花后160天时含量又达到一个高峰,随后变化缓慢;精胺在威代尔葡萄成熟期含量不断增加,花后110天达到最大值0.058mg/kg,之后含量逐渐降低。亚精胺在整个成熟和后熟期含量整体增加,花后140天含量达到最大值0.113mg/kg,之后急剧下降。