研究背景阿霉素（Doxorubicin,DOX）是目前应用最广泛、最有效的蒽环类抗癌药物之一,但是,DOX引起的心脏毒性严重影响了癌症幸存者的生活质量,限制了其在临床上的广泛应用。截至目前,尚未发现能对DOX所致心脏毒性起到显著预防或治疗作用的心肌保护剂。白藜芦醇（Resveratrol,RES）是一种天然多酚类化合物,具有抗氧化、抗炎和抗癌等特性。多项临床前和临床研究显示,RES不仅能够防治心脏疾病,而且能够提高DOX的抗癌效果。因此,RES在DOX所致心脏毒性的防治中具有广阔的应用前景。然而,RES发挥保护作用的具体分子机制仍不清楚。尽管RES被普遍认为是sirtuin 1（SIRT1）的有效激动剂,但是大量研究发现RES还可以调控多种其它信号通路以行使其生物学功能,即RES可以通过依赖和不依赖SIRT1信号途径发挥其保护作用。因此,在本研究模型中,RES减轻DOX所致心脏毒性的具体分子机制尚不清楚,特别是其对SIRT1的依赖性缺乏直接证据,有待进一步阐明。此外,另有研究指出腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase,AMPK）是SIRT1关键的下游靶点,它的激活在多种心脏疾病的治疗中发挥着有益作用。并且应激诱导蛋白sestrin 2（SESN2）被证明是心脏中AMPK活性的正向调节因子,它在DOX所致的慢性心肌病和扩张型心肌病模型中均有所降低。过表达SESN2可以改善DOX引起的线粒体功能障碍和线粒体自噬紊乱。相反,Sesn1和Sesn2基因消融可以抑制AMPK的活性,从而加重DOX所致的心脏毒性。然而,SESN2是否介导了 SIRT1对AMPK的激活从而发挥心脏保护作用尚不清楚。研究目的1.验证RES对DOX所致心脏毒性的保护作用是否依赖于SIRT1。2.探究SESN2是否介导了 SIRT1对AMPK的调控作用,从而减轻DOX所致的心脏毒性。3.探索SIRT1对SESN2的调控机制。研究方法将Sirt1flox/flox小鼠和心脏特异性 Sirt1敲除（Sirt1flox/flox Myh6-creEsr1,cardiac-specific Sirt1 knockout,Sirt1-CKO）小鼠随机分为8组,利用腹腔注射DOX（5 mg/kg/week,共4次）的方法构建心脏毒性小鼠模型,同时腹腔注射RES（10 mg/kg/day,共5周）进行治疗。使用超高分辨率小动物超声成像系统评估小鼠的心脏功能。使用FITC标记的麦胚凝集素（FITC-conjugated wheat germ agglutinin,FITC-WGA）染色检测小鼠心肌细胞横截面积的大小。使用Masson三色染色和天狼星红染色检测小鼠心脏胶原沉积的情况。使用实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）检测小鼠心脏和H9c2细胞中心房利钠肽（Atrial natriuretic peptide,Anp）、脑钠肽（Brain natriuretic peptide,Bnp）、结缔组织生长因子（Connective tissue growth factor,Ctgf）、肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,Tnfa）、白介素-1β（Interleukin-1β,Il1b）、过氧化氢酶（Catalase,Cat）和超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,Sod）的mRNA水平。使用免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）染色检测小鼠心脏中TNF-α、4-羟基壬烯醛（4-hydroxynonenal,4-HNE）和 3-硝基酪氨酸（3-nitrotyrosine,3-NT）的蛋白表达水平。使用免疫荧光（Immunofluorescence,IF）染色检测小鼠心脏中核因子-κB（Nuclear factor-κB,NF-κB）p65 和红系衍生的核因子 2 相关因子 2（Nuclear factor erythroid 2-related factor 2,NRF2）的核内蛋白表达水平以及血红素氧合酶-1（Heme oxygenase-1,HO-1）和醌 NADH 脱氢酶 1（NAD（P）H quinone dehydrogenase 1,NQO1）的蛋白表达水平。使用二氢乙啶（Dihydroethidium,DHE）染色、2’,7’-二乙酰二氯荧光素（2’,7’-dichlorofluorescein diacetate,DCFH-DA）染色和流式细胞术评估小鼠心脏和H9c2细胞中活性氧（Reactive oxygen species,ROS）的生成情况。使用末端脱氧核苷酸转移酶介导的 dUTP 缺口末端标记（Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling,TUNEL）染色和流式细胞术检测心肌细胞凋亡率。使用western blot检测小鼠心脏、H9c2细胞和原代心肌细胞中核内NF-κB p65、核内NRF2、HO-1、SIRT1、SESN2、P-AMPKα、AMPKα、磷酸化的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（Phosphorylated mammalian target of rapamycin,P-mTOR）、P-S6 核糖体蛋白（P-S6 ribosomal protein,P-S6）、S6、半胱天冬酶（cleaved caspase-3）和鼠双微体 2（Murine double minute 2,MDM2）的蛋白表达水平。使用免疫沉淀法检测心脏、原代心肌细胞和H9c2细胞中SESN2的泛素化水平以及SESN2和MDM2的相互作用强度。研究结果1.RES减轻DOX所致的心脏毒性依赖于SIRT11.1心脏特异性Sirt1敲除小鼠鉴定Western blot检测结果显示,Sirt1-CKO小鼠的心脏中SIRT1几乎不表达,而肝脏和肾脏中SIRT1的表达和Sirt1flox/flox小鼠无差异,证明心脏特异性Sirt1敲除小鼠构建成功。1.2 RES改善DOX所致的心功能障碍依赖于SIRT1小动物超声成像系统检测结果显示,与Sirt1fiox/flox Ctrl组相比,Sirt1fiox/flox DOX组小鼠心脏射血分数和收缩分数明显下降,收缩期左心室内径和左心室容积明显增加,这些指标的变化在Sirt1-CKO DOX组小鼠中更加明显,而RES干预可以显著改善DOX所致的心功能障碍,心脏特异性Sirt1敲除则破坏了 RES的保护作用。1.3 RES抑制DOX所致的心肌重构依赖于SIRT1FITC-WGA染色和RT-qPCR结果显示,与Sirt1fiox/flox Ctrl组相比,Sirt1fiox/flox DOX组小鼠心肌细胞横截面积增大并且心肌细胞肥大标志物Anp和Bnp的mRNA水平明显升高。Masson三色染色、天狼星红染色和RT-qPCR结果显示,与Sirt1fiox/flox Ctrl组相比,Sirt1fiox/flox DOX组小鼠心脏出现明显的胶原沉积并且心肌纤维化标志物Ctgf的mRNA水平明显升高。心脏特异性Sirt1敲除进一步加重了 DOX导致的心肌重构。RES干预可以明显降低Sirt1flox/flox DOX组小鼠的上述指标,但对Sirt1-CKO DOX组小鼠的心肌重构无显著改善作用。1.4 RES减轻DOX所致的心脏炎症反应依赖于SIRT1IHC染色和RT-qPCR结果显示,在Sirt1flox/flox小鼠和Sirt1-CKO小鼠心脏中,DOX组的TNF-α蛋白水平和Il1b mRNA水平升高。RES干预可以明显抑制Sirt1flox/flox DOX组小鼠的心脏炎症反应,但对Sirt1-CKO DOX组小鼠的心脏炎症反应无显著影响。此外,RES干预可以减少DOX诱导的NF-κB p65的核内表达,而心脏特异性Sirt1敲除抵消了 RES的保护作用。在H9c2细胞中进行的体外研究进一步证实了上述实验结果。1.5 RES抑制DOX所致的心脏氧化应激依赖于SIRT1DHE染色和IHC染色结果显示,与Sirt1fiox/flox Ctrl组相比,Sirt1fiox/flox DOX组小鼠心脏的R OS及氧化应激标志物4-HNE和3-NT生成明显增加,且上述指标在Sirt1-CKO DOX组小鼠心脏中进一步增加。心脏特异性Sirt1敲除抵消了 RES抑制DOX所致心脏氧化应激的作用。此外,RES干预可以恢复DOX引起的核NRF2蛋白及其下游抗氧化物酶HO-1和NQO1蛋白水平以及Cat和Sod mRNA水平的下调,心脏特异性Sirt1敲除则破坏了 RES的保护作用。在H9c2细胞中进行的体外研究进一步证实了上述实验结果。1.6 RES减少DOX所致的心肌细胞凋亡依赖于SIRT1TUNEL染色结果显示,与Sirt1fiox/flox Ctrl组相比,Sirt1fiox/flox DOX组小鼠心脏中TUNEL阳性细胞数明显增加,及Sirt1-CKO DOX组小鼠心脏中TUNEL 阳性细胞数进一步增加,不同于Sirt1flox/flox小鼠的是,使用RES进行干预对Sirt1-CKO小鼠心肌细胞凋亡没有明显的抑制作用。在H9c2细胞中进行的体外研究进一步证实了上述实验结果。2.RES通过激活SIRT1恢复DOX诱导的SESN2和P-AMPKα蛋白表达下降Western blot检测结果显示,RES可以恢复DOX引起的SESN2和P-AMPKα蛋白表达下降,而心脏特异性Sirt1敲除则抵消了 RES的这一作用。此外,DOX减少了Sirt1flox/flox小鼠和Sirt1-CKO小鼠心脏中mTOR和S6的磷酸化水平,RES干预没有明显改变上述蛋白的表达。H9c2细胞实验结果与体内实验结果一致。在原代心肌细胞中转染pcDNA3.1-Sirt1质粒使SIRT1高表达可以逆转DOX引起的SESN2和P-AMPKα蛋白表达下降。3.SESN2作为支架蛋白,介导SIRT1对AMPKα的激活在DOX处理的心肌细胞中,Sesn2基因沉默不仅破坏了 RES对AMPKα的激活能力,而且显著削弱了 RES的抗氧化和抗凋亡作用。然而,过表达SESN2可以明显逆转DOX导致的P-AMPKα表达下降并抑制DOX诱导的氧化应激和凋亡。但是,SESN2蛋白表达的减少和增加均对SIRT1表达无显著影响。以上实验结果表明,SIRT1通过上调SESN2激活AMPKα,从而减轻DOX所致的心脏毒性。4.SIRT1干扰心肌细胞中SESN2与MDM2的相互作用以降低DOX引起的SESN2泛素化水平免疫沉淀结果显示,RES干预逆转了 DOX引起的SESN2泛素化。进一步机制研究发现在DOX处理的心肌细胞中,通过RES干预和pcDNA3.1-Sirt1质粒转染过表达SIRT1都可以减少SESN2和MDM2的相互作用,而Sirt1缺失则消除了 RES的这一作用。此外,Mdm2基因沉默逆转了 DOX引起的原代心肌细胞中SESN2的下调,这些结果表明,激活SIRT1通过干扰心肌细胞中SESN2与MDM2的相互作用来降低DOX引起的SESN2泛素化水平。研究结论1.RES通过激活SIRT1维持心脏氧化还原平衡,抑制心肌细胞凋亡,进而改善DOX所致的心脏结构和功能紊乱。2.RES激活SIRT1发挥的抗氧化应激和抗凋亡作用依赖于SESN2。3.RES通过激活SIRT1干扰心肌细胞中SESN2与MDM2的相互作用以降低DOX引起的SESN2泛素化水平,进而上调SESN2。4.RES激活SIRT1通过上调SESN2促进AMPKα的磷酸化。5.RES激活SIRT1以减轻DOX所致心脏毒性的作用不依赖于mTOR。