研究背景EB病毒是一种全球性分布的双链DNA病毒,属于疱疹病毒科γ亚科,超过90%的人通过唾液被感染过。被EB病毒感染后,免疫系统可以通过细胞毒性T细胞(包括CD8+和CD4+)和自然杀伤(NK)细胞迅速清除被病毒感染的细胞,但是仍有EB病毒以潜伏形式终身存在于静息期B细胞中。当机体免疫系统受到抑制时,这些被EB病毒感染的细胞会出现增殖,释放EB病毒,被感染的B细胞可能转化为恶性肿瘤细胞。EB病毒已被确认与许多人类肿瘤密切相关,如B细胞淋巴瘤(包括霍奇金淋巴瘤(HD)和伯基特淋巴瘤(BL))、鼻咽癌、移植后淋巴组织增生性疾病(PTLD)等。EB病毒相关的恶性肿瘤通常不宜采用手术切除,早期对放、化疗较敏感,但是对复发的患者疗效较差,可能由于这些方法不能完全杀灭、清除肿瘤细胞,特别是转移病灶和循环系统中的肿瘤细胞。从这些恶性肿瘤的发病因素(EB病毒)出发,寻找有效的靶向治疗和免疫治疗方法是治疗EB病毒相关恶性肿瘤的研究热点。嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor, CAR)修饰的T细胞是一种结合T细胞免疫治疗和抗体靶向治疗的治疗手段,具有特异性识别并杀伤肿瘤细胞的能力,是一种全新的很有前景的肿瘤免疫治疗策略。第一代CAR由识别肿瘤表面抗原的单链抗体(scFv)和受体酪氨酸活化基序(通常为CD3ζ)组成,但第一代CART细胞在临床上并没有显示明显的治疗效果,可能是由于仅有CD3ζ信号不能使T细胞有效增殖和分泌足够多的细胞因子,所以不能在体内发挥持续抗肿瘤作用；在第二代和第三代CAR分子中引入共刺激分子信号,如CD28、CD134、 CD137等,显著提高T细胞对靶细胞的杀伤力、增殖能力、体内维持时间、细胞因子的释放等,目前在临床应用的案例已取得令人振奋的结果,有完全治愈急性或慢性淋巴细胞白血病的报道。CAR应用的关键在于确定一种肿瘤相关抗原,这种抗原在肿瘤细胞表面高表达,而在正常组织中低表达或无表达。潜伏膜蛋白1(latent membrane proteinl, LMP1)是EB病毒编码的一种癌蛋白,能够组成型激活如NF-κB在内的各种信号通路,从而导致细胞生长不受控制向癌细胞转化和对肿瘤的微环境产生影响。LMP1转基因小鼠动物模型研究发现,在B淋巴细胞中过表达LMP1,能够模拟EBV感染,导致LMP1转基因小鼠诱发淋巴瘤,所以作为外源蛋白的LMP1是一个理想的靶向治疗EB病毒相关肿瘤的靶标。因此,构建LMP1靶向嵌合抗原受体(CAR) T细胞,对表达LMP1的EB病毒相关恶性肿瘤靶向T细胞免疫治疗具有重要的理论和临床应用价值。目的本研究旨在构建LMP1靶向嵌合抗原受体T细胞(LMP1/CART);观察LMP1/CAR T细胞在体外对表达LMP1的鼻咽癌细胞及淋巴瘤细胞的杀伤作用,以及在体内对LMP1阳性鼻咽癌细胞裸鼠移植瘤生长抑制作用；初步探讨LMP1/CART细胞杀伤肿瘤细胞的机制。方法1.采用本实验室前期工作制备的抗LMP1胞外区Fab抗体(HELA)结合流式细胞术检测不同鼻咽癌和淋巴瘤细胞株表面LMP1表达。采用EB病毒感染人B淋巴细胞制备LCL细胞,通过流式检测细胞表面CD40.CD19.CD80及CD86表达。2.构建含有抗LMP1scFv序列与人IgG分子的CH2CH3以及CD28CD3ζ串联表达的第二代LMP1靶向嵌合抗原受体(LMP1-28),并将该嵌合抗原受体序列克隆到逆转录病毒和慢病毒载体上,通过逆转录病毒和慢病毒系统将该嵌合抗原受体转导至T淋巴细胞；采用流式检测表达LMP1嵌合抗原受体的T细胞,分析分别采用逆转录病毒系统和慢病毒系统获得的LMP1嵌合抗原受体T细胞的比例。3.采用CCK-8法检测第二代LMP1靶向嵌合抗原受体T细胞对鼻咽癌细胞株SUNE1-LMP1、SUNE1、 HNE2-LMP1、HNE2、C666-1及对照细胞NIH-3T3的杀伤作用；采用流式检测第二代LMP1靶向嵌合抗原受体T细胞对淋巴瘤细胞株Raji、C1R-neo、LCL、RPMI6666、Romas的杀伤作用。4.将LMP1过表达的鼻咽癌细胞株SUNEl-LMP1接种到裸鼠背部皮下,待瘤体积超过100mm3时,通过瘤内注射第二代LMP1靶向嵌合抗原受体T细胞,以空载体慢病毒感染的T细胞和生理盐水作为对照,观察第二代LMP1靶向嵌合抗原受体T细胞在体内对鼻咽癌的抑制作用。5.通过流式检测第二代LMP1靶向嵌合抗原受体T细胞的表面CD4、CD8、CD3、CD28分子的表达。第二代LMP1靶向嵌合抗原受体T细胞经LMP1抗原刺激后,采用ELISA及ELISAPOT检测IFN-γ的表达；采用ELISA检测IL-2的表达；采用流式检测T细胞内的IFN-γ和IL-2的表达。6.将CD134和CD137分子的C端信号区克隆到第二代LMP1靶向嵌合抗原受体的CD28和CD3ζ之间,构建第三代LMP1靶向嵌合抗原受体(LMP1-134和LMP1-137),克隆至慢病毒载体中,通过慢病毒感染人T淋巴细胞,获得第三代LMP1靶向嵌合抗原受体T细胞。采用流式检测第三代LMP1靶向嵌合抗原受体在T细胞中的表达。7.采用CCK-8法检测第三代LMP1靶向嵌合抗原受体T细胞在不同效靶细胞比时对LMP1阳性鼻咽癌细胞SUNE1-LMP1的杀伤作用以及在效靶细胞比为10：1是对LMP1阴性鼻咽癌细胞SUNE1的杀伤作用。通过流式检测LMP1靶向嵌合抗原受体T细胞对LMP1阳性淋巴瘤细胞C1R-neo和LMPl阴性淋巴瘤细胞Romas的杀伤作用。8.制备小鼠荷SUNE1-LMP1皮下瘤模型,待瘤体积达到100mm3以上时,分成六组,分别经尾静脉注射生理盐水、未被慢病毒感染的T细胞、空载体慢病毒感染的T细胞、第二代LMP1靶向嵌合抗原受体T细胞(LMP1-28T)、第三代LMP1靶向嵌合抗原受体T细胞(LMP1-134T和LMP1-137T),每10天注射一次,共注射3次。通过动态测量瘤体积及瘤重比较各组对肿瘤生长的抑制作用,HE及免疫组化染色观察肿瘤的坏死情况及回输的T细胞浸润到肿瘤组织的情况。9.采用ELISA检测鼻咽癌细胞SUNE1-LMP1和SUNE1以及淋巴瘤细胞C1R-neo和LCL细胞与LMP1-28T、LMP1-134T、LMP1-137T、plvx T及T细胞共培养时IFN-γ和IL-2的分泌量；采用活细胞染料eFluor670标记各组T细胞,流式检测各组T细胞在抗原刺激下的增殖情况。结果1.鼻咽癌细胞株SUNE1-LMP1高表达LMP1; B95-8细胞、LCL细胞、鼻咽癌细胞株HNE2-LMP1、C666-1,淋巴瘤细胞株C1R-neo、RPMI6666、Raji中度表达LMP1；而鼻咽癌细胞株HNE2、SUNE1,淋巴瘤细胞株Romas、Daudi没有能够检测到LMP1的表达。成功制备了一株LCL细胞,CD40阳性率为97%,CD19阳性率90%,CD80阳性率85%,CD86阳性率80%。2.成功构建第二代LMP1靶向嵌合抗原受体(LMP1-28),可在真核细胞293T中表达。采用慢病毒感染T细胞,表达LMP1-28的T细胞为62%～75%；通过逆转录病毒感染T细胞,表达LMP1-28的T细胞仅为30%～45%。3. LMP1-28T细胞对鼻咽癌细胞SUNEl-LMP1的杀伤率随效应细胞和靶细胞的比例增加而增加,在效应细胞和靶细胞比值为20：1时,LMP1-28T细胞对SUNE1-LMP1的杀伤率达到67.7±5.83%。在效应细胞和靶细胞比值在10：1时,LMP1-28T细胞对LMP1阳性的鼻咽癌细胞株SUNE1-LMP1、HNE2-LMP1、C666-1的杀伤率分别为53.5±7.52%,43.02±1.84%,29.24±2.69%,显著高于T细胞和plvx T细胞,但是对SUNE1、HNE2及小鼠成纤维细胞NIH-3T3的杀伤率仅为15.55±1.59%,15.66±4.62%,9.41±2.08%,与对照组T细胞的杀伤率没有显著差异；对淋巴瘤细胞Raji、C1R-neo、RPMI6666和LCL的杀伤率分别为33.10±5.17%,71.48±7.49%,32.93±5.08%和54.44±5.79%,显著高于T细胞和plvx T细胞,但是对Romas的杀伤率与对照组比较没有显著差异。4.荷SUNE1-LMP1皮下瘤裸鼠经瘤内注射LMP1-28T细胞后,肿瘤的体积显著小于生理盐水组和plvx T细胞组。5. LMP1-28T细胞与SUNE1-LMP1细胞共培养后,培养上清中的IFN-γ含量为1687.9±353.6pg/ml, IL-2的含量为1524.06±110.1pg/ml,显著高于对照T细胞组；与SUNE1细胞共培养后,培养上清中的IFN-γ含量为214.4±21.1pg/ml,IL-2的含量为12.73±3.79pg/ml,与对照组T细胞没有显著差异。流式检测LMP1-28T细胞内的IL2及IFN-γ,结果显示有44.96±2%的CD8+细胞表达IL-2,有55.23%±4.17%的CD4+细胞表达IL-2；有37.94±2.96%的CD8+细胞表达IFN-γ分子,有26.99±6.09%的CD4+细胞表达IFN-γ,与对照T细胞比较有显著差异。6.成功构建第三代LMP1靶向嵌合抗原受体(LMP1-134和LMP1-137),可在293T细胞中表达。流式检测结果表明,LMP1-134和LMP1-137能够在T淋巴细胞中表达,慢病毒感染T细胞的效率在72%左右。7.第三代LMP1靶向嵌合抗原受体T (LMP-134T和LMP1-137T)细胞在效靶细胞为20：1,10：1,5：1,2：1时对LMP1阳性的鼻咽癌细胞SUNE1-LMP1的杀伤率分别为72.67±6.03%和77.96±3.32%,56.84±5.15%和56.08±4.48%,42.61±5.96%和43.22±4.47%,21.84±1.95%和24.27±3.64%,与T细胞及plvx T细胞比较有显著差异,但与LMP1-28T细胞比较没有显著差异；各组T细胞对鼻咽癌细胞SUNE1的杀伤率没有显著差异；LMP1-134T和LMP1-137T细胞对淋巴瘤细胞C1R-neo的杀伤率为74.37±5.10%和75.80±2.3%,与T细胞及plvx T细胞比较有显著差异,但与LMP1-28T细胞比较没有显著差异。8.T细胞组、plvx T细胞组、LMP1-28T细胞组、LMP1-134T细胞组、LMP1-137T细胞组的体内实验抑瘤率分别为4.9%,9.0%,46.5%,57.7%,65.2%,LMP1-134T细胞组与LMP1-28T细胞组的肿瘤体积没有统计学意义,但LMP1-137T细胞组与LMP1-28-3T细胞组比较在40d和44d差异有统计学意义(P=0.049和P=0.03)。肿瘤组织学观察表明经LMP1-28T、LMP1-134T和LMP1-137T治疗的小鼠肿瘤组织出现大面积坏死,并可见有大量淋巴细胞浸润,免疫组化证明浸润的淋巴细胞是人T淋巴细胞。而经对照T细胞及plvxT细胞治疗的小鼠肿瘤组织坏死面积较小,浸润的淋巴细胞也较少。9. LMP1-28T、LMP1-134T、LMP1-137T与SUNE1-LMP1共培养后细胞上清的IFN-γ分别为1655.9±149.8pg/ml,1790.4±105.4pg/ml,2022±109.9pg/ml,两两方差分析结果表明LMP1-137T细胞分泌的IFN-γ与LMLP-28T细胞和LMP1-134T细胞差异有统计学意义(P=0.000和P=0.010),但LMP1-28T细胞和LMP1-134T细胞组之间差异没有统计学意义(P=0.106)。上述各组培养上清中的IL-2的量分别为1187±86pg/ml,1445.4±138.6pg/ml,1459.9±65.7pg/ml,两两方差分析表明LMP1-134T和LMP1-137T细胞分泌的IL-2与LMPL1-28T细胞差异有统计学意义(P=0.001和P=0.001)。结论1.在本实验中采用慢病毒感染T细胞比逆转录病毒感染T细胞的效率更高,成本更低,因此本实验采用选择慢病毒系统修饰T细胞,获得LMP1靶向嵌合抗原受体T细胞。2.本研究所制备的第二代和第三代LMP1靶向嵌合抗原受体T细胞对LMP1阳性的鼻咽癌细胞和淋巴瘤细胞均有特异杀伤作用,在体内都能够特异抑制鼻咽癌的生长。在第二代LMP1靶向嵌合抗原受体上增加免疫共刺激信号分子CD134或CD137所制备的第三代LMP1靶向嵌合抗原受体T(LMP1-134T和LMPL1-137T)细胞,能够比第二代LMP1靶向嵌合抗原受体T细胞在体内更有效地抑制鼻咽癌生长。3.本研究所制备的第二代和第三代LMP1靶向嵌合抗原受体T细胞在受到LMP1阳性肿瘤细胞刺激后均能够特异性分泌细胞因子IFN-γ和IL-2。LMPL1-137T细胞比第二代LMP1靶向嵌合抗原受体T细胞分泌更多的IFNγ,LMPL-134T和LMP1-137T细胞比第二代LMP1靶向嵌合抗原受体T细胞分泌更多的IL-2,并且增殖能力较第二代LMP1靶向嵌合抗原受体强。