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结核病(Tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)所导致的慢性传染病,自上世纪80年代中期以来,结核杆菌感染趋势增高,迫切需要新的诊断抗原来准确地发现结核病人以便及时对其进行治疗。采用DNA芯片技术比较分析了结核分枝杆菌H37Rv和BCG的全基因组,发现两者间存在多个不同片段,这些片段被命名为RD(Regions of deletion,RD)区,依次编号为RD1-16,并证实其中有12个RD区片段在所有的卡介苗(M.bovis bacille Calmette-Guérin,BCG)中都缺失。研究这些缺失区基因所编码的蛋白,我们有可能发现新的、有价值的的特异性诊断抗原和作为新疫苗的抗原。本文对RD1区的Rv3874、Rv3875、RD4区的Rv0222、以及非RD区的Rv3615c进行研究。Rv3874和Rv3875能诱导机体产生细胞免疫反应和体液免疫反应,而且仅存在于致病性分枝杆菌中,BCG及其他非致病性分枝杆菌缺乏这二个基因,而且二者在结核诊断、预防中的应用已成为当前研究的热点。有国外研究报道表明,Rv0222比其他抗原具有较高水平的特异性和灵敏性,Rv3615c在细胞免疫水平上能够引起强烈的IFN-γ反应,但是还没有关于它的在体液免疫方面的报道。但由于菌种、地域差异等等原因,同样的抗原表现不尽相同,所以,从BCG缺失区基因编码的蛋白中筛选出有潜力作为我国结核病特异性诊断的抗原蛋白,以及验证RD区与非RD区抗原比较是否真的更具有免疫原性优势,将会使结核血清抗体检测技术真正成为临床重要的快速辅助检测手段。我们分别对结核分枝杆菌Rv0222、Rv3615c、Rv3874、Rv3875这四个基因进行了扩增并确定了最优的PCR反应条件,然后目的片段与载体pET32a(+)连接成重组质粒,鉴定正确后在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了相应的重组蛋白,通过亲和层析获得高纯度的重组蛋白,并获得了诱导以及纯化过程的最优参数,重组蛋白pET32a-0222、pET32a-3615c、pET32a-3874、pET32a-3875最适合的表达条件分别为:1.0mmol/L的IPTG,37℃,诱导5h;1.0mmol/L的IPTG,20℃,诱导6h;1.0mmol/L的IPTG,37℃,诱导3h;1.0mmol/L的IPTG,37℃,诱导4h。经Bradford检测,得到的重组pET32a-0222、pET32a-3615c,pET32a-3874蛋白终浓度分别为0.518 mg/mL、0.468mg/mL、1.697mg/mL。最终得到的蛋白为结核杆菌特异性诊断抗原的设计和筛选奠定了基础。