目的当前,伴随着我国人口老龄化问题的急剧加重,一些神经系统退行性疾病,如阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)的发病率日益增加。这些疾病不仅严重威胁着老年人口的生命健康,而且极大地增加了社会负担。在此类疾病的治疗上,中西医结合的方法目前越来越显示出其优越性。中医学认为,中枢神经系统损伤的发生,病机虽较复杂,但归纳起来不外乎内因和外因两方面,而且内外因在一定条件下相互影响、相互作用。中医结合现代研究成果认为,中枢神经系统疾病病位虽在脑髓,但是由于脏腑经络、阴阳气血失调所致。对中枢神经系统疾病,中医的治疗原则是遵循整体观念与辨证论治宗旨,根据“急则治其标、缓则治其本”及“异病同治、同病异治”的原则,与西医治疗相结合,贯穿于中枢神经系统疾病神经修复的全过程。“肝肾与脑相关”的认识由来已久。肾主骨生髓,输精髓以充盈脑海,为脑活动提供了物质基础；“肾藏精、精生髓、髓充脑、脑主元神”。肾脑结构上相互联属,从经络结构上,脑与肾在体表通过督脉和足太阳膀胱经相互沟通,在里肾主骨生髓,髓充为脑,通过骨、髓发生联系。脑与肾是脑与脏腑间关系最为密切的一对。经络结构上所形成的“脑—督脉—肾”子午线,是人体生命活动的根本,故又称为“生命线”。由此可见,中医理论历来有“肝肾与脑相关”的认识。山茱萸作为补益肝肾的代表中药,在临床有着较好的疗效,我国自古就有山茱萸应用于糖尿病(中医称为“消渴症”)治疗的记载。现代药理学研究表明,山茱萸属植物中含有挥发性成分、环烯醚萜类成分、鞣质和黄酮等4大类成分,还含有大量的小分子化合物和有机酸,5-羟甲基糠醛(5-Hydroxy-methylfurfural,5-HMF)即为其中一种。通过前期研究(“山茱萸炮制机理研究”,国家科技部“十五”攻关课题2001BA701A1l),明确了山茱萸酒蒸后药效增强,其中补益肝肾作用更加明显,山茱萸制品总提液石油醚萃取部位、醇沉多糖部位、二氯甲烷萃取部位、正丁醇萃取部位等为山茱萸炮制增效的活性部位,初步了解了这几个溶剂萃取部位的化学成分,明确山茱萸炮制前后没食子酸、维生素E、5-羟甲基糠醛等含量明显增加。近年来的研究表明：5-羟甲基糠醛具有增强大鼠红细胞变形活性及抗氧化、改变血液流变学等对人体有益的作用。对由H2O2和葡萄糖所致损伤后的血管内皮细胞具有保护作用,可逆转SOD活力减低,推测抗氧化作用可能是其保护血管内皮细胞的机制之一。因此,本研究在前期课题“山茱萸炮制机理研究”和“山茱萸活性部位、成分对衰老及相关模型影响的研究”(国家自然科学基金,30772851)的基础上,基于中医“肾脑相关”的理论基础,开展对我国滋阴补肾经典药材山茱萸的活性成分——5-羟甲基糠醛(5-HMF)对神经细胞的保护作用及机理研究。此研究对阐明5-HMF的药理作用,特别是其存在或产生对中药及其复方疗效的影响有一定的意义。方法采用大、中、小三个不同剂量的山茱萸水煎液灌胃家兔,通过抽提灌胃后家兔的脑脊液,分别运用HPLC口UPLC-MS两种方法,来检测家兔脑脊液中5-HMF的含量。透射电镜下观察空白对照组、H2O2模型组和加药组(大、中、小三个剂量5-HMF)的海马细胞形态并拍照。MTT实验检测空白对照组、H2O2模型组和加药组的细胞活力。利用2,4-二硝基苯肼反应和黄嘌呤氧化酶法分别检测空白对照组、模型组和加药组内LDH、SOD的变化,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。Real time-PCR对bcl-2、p53、Bax和caspase-3等与凋亡相关的基因mRNA表达水平进行检测,Western blot对bcl-2、p53、Bax和caspase-3等基因蛋白表达水平进行检测。结果通过HPLC,在山茱萸水煎液大剂量组灌胃后所取家兔脑脊液中能检测出5-HMF,而中、小剂量组灌胃后所取家兔脑脊液未能检测出5-HMF。而运用UPLC-MS分析,结果发现大、中、小三个剂量组的脑脊液中都能检测到5-羟甲基糠醛。电镜下,空白对照组神经元细胞核形态正常,核膜完整,染色质分布均匀；神经元内多数线粒体正常。模型组可见细胞核明显固缩,核膜不完整,胞质内有大量空泡；神经元内线粒体肿胀,嵴断裂变化明显。5-HMF大剂量组(终浓度10umol/L)可见胞质内有少量空泡,核膜基本完整；神经元内部分线粒体肿胀。而5-HMF中、小剂量组电镜下未见明显改变。MTT实验结果表明,H202可引起模型组海马神经细胞活性降低,与空白对照组相比差异有显著性(P<0.05),而5-HMF大剂量组、中剂量组可抑制过氧化氢损伤引起的活性降低(P<0.05),5-HMF小剂量组与模型组相比无显著差异(P>0.05)。LDH、SOD检测结果表明,模型组细胞LDH活性比空白对照组有明显升高(P<0.01),而5-HMF大、中剂量组使得H202诱导损伤的细胞培养液中LDH活性明显下降(P<0.01)；模型组细胞SOD活性比空白对照组有明显下降(P<0.05),而5-HMF大、中剂量组使得H202诱导损伤的细胞培养液中SOD活性显著升高(P<0.01)。流式细胞仪检测结果显示,模型组细胞凋亡率比空白对照组有明显升高,而5-羟甲基糠醛大、中剂量组对H202损伤的海马神经细胞的凋亡率有明显的抑制作用,也反映了一定程度的保护作用。Real time-PCR实验结果显示,caspase-3模型组与空白对照组相比,有显著性差异(P<0.05), bax, p53,和bcl-2模型组与空白对照组相比,差异极显著(P<0.01)；5-HMF大剂量组作用后,bax, p53,和bcl-2与模型组相比,差异极显著(P<0.01),而caspase-3与模型组相比,无显著差异；5-HMF中剂量组作用后,bax和bcl-2与模型组相比,差异极显著(P<0.01),p53与模型组相比,有显著性差异(P<0.05),而caspase-3与模型组相比,无显著差异。Western Blot实验结果显示,bax, p53,bcl-2和caspase-3模型组与空白对照组相比,有显著性差异(P<0.05);5-HMF大、中剂量组(10μM,1uM)作用后,bax, p53, bcl-2和caspase-3的蛋白表达水平与模型组(model)相比,差异极显著(P<0.01)。结论根据上述实验结果,我们得出如下结论：①5-羟甲基糠醛能通过血脑屏障,进入脑脊液中直接对神经细胞发挥作用。②5-羟甲基糠醛在一定浓度下,能够发挥抗氧化作用,可以抑制H202诱导的大鼠海马神经元的凋亡,其机制可能与其增加Bcl-2基因表达,降低p53、Bax和caspase-3基因的表达有关。