[背景和目的]中药研究的一个重点和难点问题就是理解中药方剂复杂化学体系与病证发展生物系统的相互作用,阐明中药方剂微因多效的分子机制。近些年从分子细胞水平探讨中药方剂多成分多靶点的作用也已经取得令人可喜的成绩,为中药方剂的研究奠定了坚实的基础。活血化瘀法是中医治疗肿瘤的大法,丹参作为活血化瘀药的代表,在临床主要用于心血管疾病的治疗,另外在抗肿瘤治疗中也是常用的中药之一,治疗肝癌的复方中几乎都含有丹参。临床上应用的多是丹参水提物或者注射液,基于“单成分应用于多种疾病的”理论,在丹参水溶性成分中其物质作用基础是什么?是否通过影响两种疾病的共同因素发挥作用?实验室前期通过数据挖掘工具分析探究丹参有效成分抗肿瘤的相关靶点,发现血管紧张素Ⅱ1型受体ATIR (Angiotensin Ⅱtype1receptor)在心血管疾病和肿瘤生长、转移特别是肿瘤血管生成中都有重要的作用。因此,我们期望探究丹参水溶性成分是否通过影响肿瘤细胞ATIR干扰肿瘤血管生成,以进一步阐明丹参多成分多靶点治疗疾病的分子机制。[实验内容]本文以恶性程度高、血管依赖性强的肝癌为病理模型剖析丹参水溶性成分是否通过调节肝癌细胞ATIR蛋白的表达影响肝癌血管生成。第一章考察了临床肝癌样本中ATIR与血管生成指标VEGF、MVD(微血管密度)的相关性。第二章从丹参水溶性成分中筛选能够影响AngⅡ-AT1R轴的有效成分,利用小鼠海绵植入血管生成模型筛选了丹参4种水溶性成分,分别通过检测海绵中血红蛋白含量、小鼠血清中VEGFA的浓度、HE染色血管计数及免疫组化计数初步筛选出有效成分。接着通过体内外实验进一步确证筛选出的成分的作用和机制。第三章考察有效成分在肝癌血管生成中的作用,利用Western bloting和细胞免疫荧光技术筛选ATIR高表达的细胞株,MTS法考察有效成分对AngⅡ诱导下肝癌细胞增殖的影响,利用WB和ELISA法检测有效成分对AngⅡ诱导下肝癌细胞ATIR蛋白表达及细胞上清中、VEGFA浓度的影响,最后考察有效成分对肝癌裸鼠移植瘤瘤体积和血管生成的影响。[研究结果]第一章通过免疫组化检测40例肝癌样本,发现肝癌组织中AT1R的表达与VEGF的表达、MVD均呈正相关,表明在肝癌血管生成中AT1R是一个重要的因素。第二章通过海绵植入模型的筛选及海绵中血红蛋白、小鼠血清VEGFA的浓度检测、海绵切片血管计数等方法,我们发现在4种水溶性成分中丹酚酸B2mg/Kg能够有效地抑制AngⅡ诱导的血管生成,免疫组化结果显示丹酚酸B能够下调血管内皮AT1R蛋白的表达及VEGFA的产生。为进一步证实丹酚酸B的作用,结果表明丹酚酸B对AngⅡ诱导的原代脐静脉内皮细胞(HUVEC)的增殖没有显著影响,但能够有效抑制AngⅡ诱导的HUVEC的迁移和管腔形成。WB实验表明,丹酚酸B能够剂量依赖性地下调AngⅡ诱导的HUVEC中AT1R蛋白表达,ELISA实验表明,丹酚酸B能够剂量依赖性的减少细胞上清中VEGFA的浓度。利用斑马鱼血管生成模型进一步证实丹酚酸B的整体作用,实验表明丹酚酸B能够有效抑制AngⅡ诱导的斑马鱼血管生成。第三章首先通过筛选肝癌细胞中AT1R高表达的细胞株,确定了表达程度最高的2株：SMMC7721和HepG2,丹酚酸B对2株肝癌细胞的增殖及AngⅡ刺激下的增殖均无显著的影响,但能够剂量依赖性的下调肝癌细胞AT1R的表达及细胞上清中VEGFA的含量,最后通过SMMC7721裸鼠移植瘤实验发现丹酚酸B能够有效的抑制肝癌移植瘤的生长,但体外实验证实其对肝癌细胞的增殖没有显著的影响,那么是否是通过影响血管生成的结果呢?通过免疫组化实验证实丹酚酸B能够剂量依赖性的下调移植瘤中AT1R蛋白的表达及VEGFA的表达,同时减少肝癌组织中CD34的表达。[结论和意义]实验结果表明丹参水溶性成分中丹酚酸B通过下调血管内皮细胞中AT1R蛋白的表达,减少血管内皮细胞VEGF的自分泌,从而抑制AngⅡ诱导的内皮细胞的迁移和管腔形成。在肝癌中,丹酚酸B通过下调肝癌细胞的AT1R的表达,减少肝癌细胞的VEGF的分泌,从而影响VEGF以旁分泌的形式作用于血管内皮细胞,抑制了肝癌血管生成。本课题的意义在于：①为阐明丹参多成分多靶点治疗疾病的分子机制提供一定的依据；②揭示了肝癌血管生成中重要的因素,为临床治疗肝癌提供借鉴意义。