【摘 要】
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诺如病毒（Norovirus）又称诺瓦克病毒（Noroviruses,NVs）,该病毒属于杯状病毒家族,是一种无包膜的、单股正链的RNA病毒,是引起全球流行性急性胃肠炎散发病例和爆发疫情的主要病毒病原体。抵抗力弱的人群中有很高的发病率,如儿童、老年人以及免疫异常人群感染诺如病毒后容易出现死亡或转为慢性疾病。其中GII.4型诺如病毒在过去的几十年中一直处于主导地位。2014-2015年冬季一种新型的
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诺如病毒（Norovirus）又称诺瓦克病毒（Noroviruses,NVs）,该病毒属于杯状病毒家族,是一种无包膜的、单股正链的RNA病毒,是引起全球流行性急性胃肠炎散发病例和爆发疫情的主要病毒病原体。抵抗力弱的人群中有很高的发病率,如儿童、老年人以及免疫异常人群感染诺如病毒后容易出现死亡或转为慢性疾病。其中GII.4型诺如病毒在过去的几十年中一直处于主导地位。2014-2015年冬季一种新型的GII.17变异体的出现,成为中国的流行毒株,导致急性胃肠炎暴发显著增加。全球最重要的食源性疾病里,诺如病毒是公认的最重要的病原体之一。特异性的商品化的诺如病毒疫苗至今都没有在国内上市,因此为了人类的健康安全,研制出有效的诺如病毒疫苗是非常有必要的。诺如病毒可以自行组装成不含RNA的病毒样颗粒（virus-like particle,VLP）,由于VLP在结构和抗原性方面与天然病毒粒子相似,可以诱导高水平的免疫应答,具有免疫原性和受体结合特性,是研发诺如病毒疫苗的有效方法。本研究拟利用本课题组高效的家蚕生物反应系统制备针对诺如病毒流行毒株的VLP疫苗,为诺如病毒的预防和控制提供有效保护手段。本研究首先选取了河南最新报道毒株GII.17型NV HN01/2015基因序列（KT992785）为研究对象。尝试在传统的杆状病毒昆虫细胞表达系统中表达VP1蛋白,进一步探索在家蚕生物反应器中生产诺如病毒VLP疫苗。将GII17.VP1序列进行全基因合成,随后将其克隆至p YBDM-IM和p UCDM-XIGP两个杆状病毒转移载体上,进一步包装出具有双拷贝的重组杆状病毒,并感染Sf9细胞后,通过WB检测显示,在Sf9细胞中成功表达出诺如病毒VP1蛋白。随后用钴离子亲和层析纯化VP1蛋白,利用SDS-PAGE凝胶电泳检测,发现能够获得预期的阳性条带且显示的条带单一清晰亮度高的VP1蛋白,此蛋白具有较好的可溶性。进一步通过电镜观察,能够检测到大小约为32nm的病毒样颗粒,证明所表达的VP1蛋白能够自我组装形成VLP。随后将转移载体重组至家蚕Bm Mulit Bac感受态细胞,尝试在家蚕杆状病毒表达系统中对VP1蛋白进行了表达,成功的包装出家蚕Bm BV-IM-ph-GII17.VP1重组杆状病毒,感染家蚕及Bm N细胞后,进行Western Blot检测,发现在家蚕细胞内成功表达出VP1蛋白。进一步对于本实验室表达的诺如病毒VLP进行了小鼠免疫,并检测其免疫原性,发现重组免疫蛋白可以引起小鼠机体的免疫应答并诱发小鼠产生针对诺如病毒VP1的特异性抗体。本研究率先利用昆虫细胞及杆状病毒家蚕生物反应器表达系统成功获得了诺如病毒VLP,为诺如病毒疫苗生产提供了新的方法。
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