研究背景：胶质母细胞瘤(GBM)是中枢神经系统最致命的疾病之一,大多数GBM患者的生存期是12个月。目前针对GBM的治疗方法有手术、化疗和放疗等。然而,多数GBM患者的生存时间只增加了3个月。影响其彻底治愈的因素有肿瘤的手术后复发,肿瘤对周围正常组织的浸润,以及固有或获得性放化疗耐药性的产生。虽然针对DNA-甲基化的药物制剂替莫唑胺(TMZ)已经用于神经胶质瘤的治疗,多个生长因子受体如PDGFR、表皮生长因子受体已经作为治疗靶点。在体外培养的肿瘤细胞中加入PDGFR/c-KIT abl激酶抑制剂显著降低了细胞的活性和非贴壁生长的趋势。但临床上只有10-20%的患者对这些抑制剂产生治疗效果。由于耐药性的产生,大多数病人随后表现出肿瘤快速生长。威尔逊等人发现RTK配体的抑制剂可以逆转肿瘤的固有耐药和获得性耐药。然而其具体的作用机制尚未完全阐明。伊马替尼是最具代表性的RTK抑制剂。在体内外的神经胶质瘤模型中已经证实伊马替尼可抑制肿瘤生长。我们前期试验中构建了耐伊马替尼的GBM细胞株U251AR,通过二维差异凝胶电泳法(2D-DIGE)和蛋白质质谱分析法研究与GBM化疗耐药性相关的蛋白质。蛋白质组学在研究蛋白质特性方面有着极为重要的作用。2D-DIGE对蛋白分离和量化相当敏感。蛋白质通过与不同的荧光染料标记后混合,通过凝胶分离。蛋白质组学方法为我们探索肿瘤的多药耐药、寻找肿瘤生物标志物和治疗靶点方面提供新的机遇。聚合酶Ⅰ和转录释放因子(PTRF),最早称为cavinl,在体外培养细胞中参与蛋白质转录复合物的解离。PTRF存在于细胞膜表面,与胞膜小泡转运,胆固醇平衡和脂类分解的调控有关。PTRF突变与人类先天性全身性脂肪代谢障碍有关。基因相互作用研究表明,PTRF除有上述功能外,还可能有其他功能。在前列腺癌和肺癌中,PTRF表达的缺失被认为与肿瘤增殖有关。PTRF的胞质微囊结构蛋白和caveolinl在乳腺癌的化疗多药耐药中有着至关重要的作用。PTRF可诱发多种体外培养细胞及斑马鱼胚胎细胞中形成丰富的胞质微囊。PTRF和caveolinl在细胞质微囊中有着密切联系。已有报道表明caveolin蛋白位于胞质微囊,其对微囊本身有着至关重要的作用。Quann和他的同事发现,在胶质母细胞瘤细胞株U87中过表达caveolinl可抑制细胞生长和生存。与正常脑组织中的星形细胞相比,caveolinl在胶质母细胞瘤细胞中的表达量明显增多。在人类胶质母细胞瘤体内外模型中,瘤细胞耐受TMZ后影响了caveolinl的表达。然而,PTRF在胶质母细胞瘤中的相关研究却很少。因此,在本实验中,我们研究PTRF在胶质母细胞瘤细胞株及临床标本中的表达和相关功能。并分析PTRF在胶质母细胞瘤细胞耐药性中的作用。我们的数据表明PTRF可成为胶质母细胞瘤患者治疗的新靶点,对胶质瘤的治疗可能具有重大意义。目的：本研究通过构建胶质母细胞瘤细胞系U251的化疗耐药细胞株U251AR,并通过荧光标记的双向电泳技术及蛋白质谱技术测定U251及U251AR差异表达的蛋白；通过western blot及QRT-PCR验证差异表达蛋白PTRF在各细胞株中的表达。并构建干扰质粒敲除PTRF在U251及U251AR中的表达,MTT及细胞耐药性进一步证实PTRF在胶质母细胞瘤化疗耐药性中的作用。同时,我们研究PTRF的协同蛋白caveolinl在U251AR细胞系中表达。最后,我们免疫组化及QRT-PCR技术在原发性胶质母细胞瘤及常规化疗后复发的胶质母细胞瘤患者的组织标本中的表达,我们通过相关性分析PTRF及caveolin1在所有胶质母细胞瘤患者中的相关情况。实验方法：1、组织标本的收集病人标本收集于珠江医院和南方医院(南方医科大学、广州、中国)。研究对象包括Ⅰ级星形细胞瘤8例,Ⅱ级星形细胞瘤13例,Ⅲ级星形细胞瘤10例,胶质母细胞瘤27例。在27个胶质母细胞瘤表本中,6例在接受TMZ治疗6个月后复发。在标本收集之前,根据南方医科大学伦理学机构的指导方针,所有患者给予书面告知并取得知情同意。在手术室手术切除组织样本后立即快速冰冻。肿瘤及非肿瘤组织由神经病理学教授诊断鉴定。正常组织鉴定标准为：根据病检证实未发现有肿瘤细胞。对于每一个病人,留取肿瘤组织样本(存储在-80摄氏度冰箱)和石蜡包埋组织标本。2、细胞培养及耐药细胞株的构建人类GBM细胞株U251由南方医科大学公共卫生学院馈赠。多药耐药细胞株U251AR由本实验室构建并培养。细胞株使用DMEM高糖培养液培养(含10%胎牛血清FBS,青霉素200U/毫升和链霉素100μg/毫升)。细胞在37℃,5%的二氧化碳,湿润的培养箱中生长。通过对U251细胞株不断增加伊马替尼(STI571)的浓度,本实验室成功构建具有伊马替尼耐药的细胞系U251AR.为保持U251AR细胞多药耐药性,在U251AR细胞的培养基中添加伊马替尼(浓度122μg/毫升)。3、细胞免疫荧光调整细胞密度为3×105细胞/孔,置于Lab-Tek双孔载玻片并孵育过夜.隔日,当细胞铺满50-70%,PBS清洗两次后用4%多聚甲醛固定和0.1％Tritonx-100,4摄氏度下渗透30分钟。然后PBS清洗细胞3次并用封闭液孵育。成功后加入PTRF或caveolinl一抗,4摄氏度下过夜。之后PBS清洗3次,加入二次抗体山羊抗兔Alexa Fluor488(1:1,000)室温下暗室静置1h。最后,PBS清洗3次,加入0.25毫克／毫升DAPI室温下暗室静置1分钟。PBS足量清洗,恒定曝光条件下,使用激光共聚焦扫描显微镜60倍下观察。4、U251及U251AR细胞的蛋白提取从U251和U251AR细胞株细胞提取细胞裂解液。加入冰冻裂解缓冲液和裂解混合液,机械破坏细胞。样本经超声处理(冰浴,每次10秒,30秒后重复6次)和离心(15000g,30分钟,4摄氏度)。超速离心108000转,60分钟,4摄氏度下提取上清液。Bradford蛋白质分析法测定浓度和所提取蛋白质(100μg)在-80摄氏度保存。5、蛋白的荧光标记蛋白提取物按CyDyes DIGE Fluors (GE Healthcare, Bucks, UK)推荐说明书处理,使用CyDyesFluors荧光素标记。简而言之,每50μg样本的最少加入400pmol胺反应类花青染料(Cy3或Cy5)暗室中冰浴30分钟。U251和U251AR都用Cy5或Cy3不同的凝胶标记。Cy2荧光染料标记内参照,将等量的U251和U251AR细胞共培养。黑暗中加入10mM赖氨酸,冰浴10分钟后终止标记反应。标记反应物,U251和U251AR细胞提取物与内参照一起,加入DestreakTMIEF缓冲液达到450μl,放入5个24厘米长的凝胶片。6、荧光双向电泳的制备及蛋白电泳分析使用IPGphorTM系统完成等电点电泳。预先固定pH梯度胶(pH值3-10,24厘米),用于单向分离。IEF之后,IPG条带环境温度下在含有65mM DTT和250mM碘乙酰胺的平衡溶液中孵2次,各15分钟。条被直接置于预制的12%sds-page凝胶顶部并在Ettan DaltSix系统垂直电泳约5小时。另一个凝胶跑带以同样的方式选择蛋白质。7、2D-DIGE凝胶成像及数据分析在凝胶电泳后,cyanine标记的蛋白质在TyphoonTM9400成像仪荧光模式下直接可视。Cy2, Cy3, Cy5图像分别用488nm,532nm和633nm激光扫描所得。每个凝胶在200μm分辨率(像素大小)下扫描,使用DeCyder处理软件V5.01对其进行量化、凝胶匹配和统计分析。为消除图像的人为影响和图像中蛋白质斑点的差异量化使用DIA对每个凝胶的两个样品在(U251和U251AR)予以配对比较。使用BVA,同时对比凝胶匹配图中所有的蛋白斑点。使用S检验(p<0.05)进行统计分析。标准化后,蛋白质斑点至少在1.5倍以上的体积的变化被认为调控差异。统计分析计算结果与Engelen K. et al报道的结果基本相似。双凝胶匹配的斑点以的标准偏差log10条件下计算分析。计算每个条件下标准差的中位数。2D-DIGE成像和分析后,考马斯兰染制备凝胶。凝胶进行扫和存储在1%醋酸,4摄氏度下完成,直到斑点消失。手动匹配考马斯兰凝胶与荧光地图,使用Image MasterTM2d软件选择分析。8、质谱鉴定考马斯蓝染色的蛋白质斑点从双向凝胶中切除并用EttanTM斑点处理工作站软件处理。胶填充物用MilliQ水洗3次,然后用50%甲醇/50mM碳酸氢铵和75%ACN冲洗,确保完全去除染料和洗涤剂。干燥后,凝胶块在20毫NH4HCO3和16.6μg/毫升猪胰蛋白酶再次水化60分钟。分别连续添加50%的ACN和50%的TFA完成提取。消化产物脱水后,在斑点到达MALDI靶点之前,溶解在含2毫克/毫升a-cyano-4-hydroxycinnamic酸的70%ACN/0.1%TFA中。MALDI-TOF/TOF质谱计获得肽团块印记,使用FlexAnalysisTM软件生成峰值列表并用胰蛋白酶的自动消化肽段做内参。峰列表然后转移至ProteinScapeTM软件,以包含自我分解的峰值和污染物为基础,做为另一个自动校准列表(与样本有类型和治疗有关)。再次校准后,自动胰蛋白酶和燃料进行了过滤和删除,得到m/z比率和高鉴别率(Score-Booster)。只有单一同位素的胰蛋白酶肽团块被用于使用Mascot search algorithm NCBI数据库序列检索。搜索条件如下：初始窗口以70ppm为内参标准,接受只错过一个断裂的团块,以碘乙酰胺和甲硫氨酸氧化变量调整半胱氨酸。使用probability-based Mowse获取结果评分(蛋白质数是-10×log(P))。P是一个随机事件发生的概率。在我们的实验中,得分大于90具有统计学意义(p<0.05)。9、Western bolt胞质蛋白提取液(10～30μg)加入12%聚丙烯酰胺凝胶进行单通道电泳。使用生物素化ECL western blotting作为分子量标记。蛋白质被转移至PVDF膜,U251, U251AR和其他细胞中提取等量蛋白,由Bradford蛋白质定量试剂盒计算单位体积的蛋白含量,在每个凝胶中加入等量的蛋白后进行量化分析。非特异性位点被含5%(w/v)脱脂奶粉的Tris-buffered盐水(TBS)封闭。斑点加入一抗后,在含有0.1%Tween20和1%脱脂奶粉的TBS中孵育。一抗主要包括：兔抗人单克隆抗体PTRF(稀释比例1：1000),兔抗人单克隆抗体caveolinl (稀释比例1：1500),兔抗人单克隆抗体VIM(稀释比例1：1000)和山羊抗人单克隆抗体P-gp(稀释比例1：150),P-actin作为内参。TBS冲洗后,印记在过氧化物结合的IgG二抗1：5000和Streptavidin-HRP(生物素化的标记)中孵育,增强化学发光体系ECL用于颜色显影。10、QRT-PCR总RNA提取使用Trizol试剂盒完成,反转录使用的引物Script RT reagent Kit。荧光定量RT-PCR根据SYBR Green试剂盒说明书进行,依据MX7500序列检测系统完成。引物在表1中列出。GAPDH作为内参。所有样品都以内参为标准量化,倍数的计算通过相对量化得出(2△△CT)。11、PTRF的干扰BLOCK-iT Pol II miR RNAi表达载体用来诱导干扰PTRF。简而言之,单链microRNA退火形成双列,插入至pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR载体(Invitrogen,USA)。针对PTRF的短发卡RNA(shRNA)被称为shPTRF。空载体为shNC。根据说明书,质粒LipofectamineTM2000转染到U251AR和U251细胞。孵化后24小时,加入500ng/mL盐酸杀稻瘟菌素。转染后,定量RT-PC检测PTRF的mRNA水平。随后,分析多个低表达PTRF的mRNA,并通过Western blotting进一步分析PTRF蛋白含量。最后,选出有效敲除PTRF的细胞株作干扰组进行分析。细胞转染空载体作为阴性对照。12、体外耐药性检测U251及U251AR细胞转染shNC和shPTRF后置于96孔板中,密度为每孔2×103个细胞,终体积为100μL。加入100μg/毫升TMZ孵化后24小时、48小时、72小时、96小时和120小时后通过CCK8法分析细胞生存能力。耐药性方面,细胞在转染后24h,再次植入从96孔板,密度为1.5×104/孔,与伊马替尼,VP-16或TMZ(50到200μg/毫升)共培养48h。13、胶质瘤患者组织标本的免疫组化鉴定组织中PTRF和caveolinl的表达水平,使用超灵敏S-P试剂盒,按试剂盒说明书完成。一抗PTRF兔单克隆抗体1：100稀释,caveolinl兔单克隆抗体1：150稀释。Poly peroxidase兔多聚过氧化物酶IgG作为二抗,切片由光学显微镜分析。阴性对照同样用一抗检测。免疫印迹部分由光学显微镜检查,物镜和目镜10x40。免疫印记强度使用图像处理软件pro-Plus6.0处理。14、统计学方法所有实验重复三次。结果均为均数±标准差(SD)。统计分析使用一个方差分析(方差分析)或t检验。同一GBM标本中PTRF和Caveolin-1mRNA水平之间的关系使用Pearson相关性检验。当P值小于0.05被认为是具有统计学意义。所有数据分析使用SPSS13.0软件完成。实验结果：1、通过持续的伊马替尼刺激U251细胞,我们构建了耐伊马替尼的GBM细胞株U251AR,同时我们检测到U251AR对VP-16和TMZ产生耐药。为了维持U251AR的多药耐药性,我们在培养U251AR的培养液中加入伊马替尼(122μg/毫升)。本研究发现耐药细胞株U251AR的一些耐药基因表达与U251相比明显高表达。我们通过免疫印迹检测ATP-依赖性药物外泵(P-gp)蛋白的表达,并用定量RT-PCR法对U251AR和U251细胞中和P-gp、MRP1和BCRP mRNA水平进行测定。耐药细胞株U251AR中P-gp, MRP1和BCRP的表达增加(*,P<0.05)。这些结果表明,耐伊马替尼的GBM细胞株U251AR构建成功。2、为获得U251和U251AR细胞整体蛋白情况,我们使用三个双向凝胶电泳检测两种细胞系中不同蛋白质的表达。对于每个凝胶,综合后的图像源于U251,U251AR和内参样本。与Cy3和Cy5-标记图像的代表DIGE凝胶如图所示。使用DeCyder软件在DIA工作区共发现2516-2735斑点。在BVA模块中,U251AR与U251相比,按给定的标准的比率大于1.5或小于1.5(P值<0.05),41个斑点差异表达,其中23个斑点衰减和18个斑点上调。由于部分蛋白由于表达水平低,导致考马斯蓝凝胶未能检测到相应斑点。MALDI-TOF/TOF MS分析发现,两个细胞系中有21个蛋白质斑点表达量显著改变。包括PTRF和VIM在内的21个差异表达蛋白质中,U251AR细胞株9个蛋白质上调,12个蛋白下调。3、为了验证蛋白质组学的结果,我们通过免疫印迹和定量RT-PCR检钡PTRF和VIM的表达。与之前的结果一样,免疫印迹和定量RT-PCR结果证实PTRF和VIM在U251AR中表达量均高于U251细胞(*,p<0.05)。为了检钡PTRF及caveolinl在两种细胞株中的表达量及表达部位,我们采用细胞免疫荧光检测U251AR和U251细胞中PTRF和caveolinl的定位及定量。PTRF在细胞核和细胞质中均有表达,U251AR细胞质中的荧光度大于U251。Caveolinl同样在细胞膜和细胞质中同时表达,且在U251AR的荧光度大于U251,以上表明U251AR比U251细胞可能拥有更多细胞质膜微囊。4、为进一步检测PTRF在GBM细胞中耐药性中的作用,我们通过pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA敲除U251和U251AR细胞系中PTRF的表达。干扰效果由Western blotting和定量RT-PCR证实(*,P<0.05)。我们同时检测了干扰组细胞的caveolin1和P-gp的mRNA水平,与我们的预期及文献报道相同,干扰组细胞的caveolinl和P-gp的mRNA表达水平与U251及U251AR相比也降低。PTRF和caveolinl细胞质微囊的两个重要结构,均被证实与肿瘤化疗耐药有关。为了检测PTRF对细胞活力的影响,我们对U251、U251AR及敲除PTRF的细胞系加入TMZ(100μg/毫升)(24小时、48小时、72小时、96小时、120小时)后对细胞活性进行分析。分析得出,在相同的TMZ浓度下,与U251、U251AR细胞相比,敲除PTRF后细胞生存能力明显降低(*,P<0.05)为检钡PTRF在GBM化学药物敏感性中的作用,U251细胞、U251AR细胞和转染细胞中加入伊马替尼,VP-16和TMZ三种药物之后,通过CCK8检测法测定其的IC50值。在加入伊马替尼,VP-16, TMZ后,shPTRF转染细胞株的IC50值较U251和U251AR细胞显著下降了2.05-3.92倍(**,P<0.01),表明PTRF的下调可增加GBM对化疗药物的敏感性。5、为了研究PTRF在胶质母细胞瘤耐药中的作用,我们通过免疫组化法检测58例星形细胞瘤患者和6例复发患者GBM组织中PTRF的表达。此外,8例正常脑组织被用作对照样本。免疫组化分析发现：PTRF在低级星形细胞瘤(Ⅰ和Ⅱ级)和正常脑组织标本中低表达,但在高级别星形细胞瘤(Ⅲ和Ⅳ级)中高度表达。我们还发现,PTRF在TMZ化疗6个月后复发的GBM患者中的表达水平高于未经化疗的患者。与PTRF一样,caveolinl在复发GBM患者中的表达水平同样增高。此外,GBM复发患者PTRF和caveolinl的mRNA水平明显高于原发的GBM患者(*,P<0.01)。由于PTRF和caveolinl在生物学特性及功能方面都是细胞质微囊的两个基本组成部分,因此,我们对同一GBM标本的PTRF和caveolin1mRNA水平做相关分析。研究表明,PTRF mRNA水平与caveolinl mRNA水平在同一GBM标本中呈正相关(2-tailed Pearson相关,r=0.766,P<0.01)。这些结果表明,在同一GBM标本中PTRF的表达水平可能与caveolinl的表达水平相关。结论：1、通过蛋白质组学研究方法,我们揭示了GBM的耐药性相关的众多因子。2、在这些因子中,在GBM的耐药性上PTRF可能扮演着重要角色。3、我们发现GBM标本的PTRF表达上调并在GBM复发患者样本中表达水平更高。4, PTRF可能作为GBM的生物标志物利于早期诊断和预后分析,成为GBM的潜在治疗靶点。