基于PI3K/AKT/mTOR自噬信号通路探讨三百棒抑制MH7A细胞增殖的作用机制

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目的:探讨三百棒醇提物(Toddalia asiatica alcohol extract,TAAE)对类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)滑膜成纤维细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)的细胞系MH7A的增殖、自噬、凋亡及其机制,为三百棒在临床上进一步开发和应用提供理论依据。方法:体外培养MH7A细胞,细胞毒性检测试剂盒(cell countin Kit-8,CCK-8)检测TAAE对MH7A细胞存活率的影响,并筛选出药物的作用浓度和时间;运用流式细胞术检测TAAE对细胞凋亡的影响,并采用自噬早期抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)和自噬晚期抑制剂氯喹(chloroquine,CQ)进一步验证自噬对凋亡的影响;采用蛋白免疫印迹法(western blot,WB)检测不同浓度的TAAE、不同时间对微管相关蛋白轻链3(light chain 3,LC3)、P62和Bcl-2相关蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、B淋巴细胞瘤-2基因(B cell lymphoma/lewkmia-2,Bcl-2)、活化的半胱氨酸蛋白酶-3(cleaved cysteinyl aspartate-specific protease-3,cleaved Caspase-3)、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositol 3kinase,PI3K),蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/AKT),哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(target of rapamycin,m TOR)及磷酸化(p)-PI3K,p-AKT,p-m TOR蛋白表达情况;3-MA和CQ验证TAAE对自噬和凋亡的的影响并用PI3K激动剂(740YPDGFR,740Y-P)验证TAAE对信号通路的抑制作用。结果:CCK-8显示TAAE在浓度为0-2mg/m L范围内,呈剂量依赖性抑制MH7A细胞的增殖(P<0.05),且随着时间的延长,其细胞的存活率越小;流式细胞术显示TAAE和CQ都诱导了细胞凋亡,CQ+TAAE的联合运用效果比药物的单一使用更明显(P<0.05);单独使用740Y-P对细胞凋亡率无明显影响,但和单独使用TAAE相比,740Y-P和TAAE联合使用时细胞凋亡率减少了(P<0.01),3-MA对TAAE细胞凋亡率无明显作用。WB显示TAAE具有剂量-时间依赖性的上调促凋亡蛋白Bax、自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和P62的表达,下调Bcl-2、p-PI3K、p-AKT、p-m TOR的蛋白表达(P<0.05);CQ上调了P62、LC3-Ⅱ、Bax、cleaved Caspase-3的蛋白表达,下调了Bcl-2是蛋白表达(P<0.05);3-MA和740Y-P削弱了P62、LC3-Ⅱ的积累(P<0.05);740Y-P上调了p-PI3K、p-AKT、p-m TOR和Bcl-2的蛋白表达,下调了cleaved Caspase-3的表达(P<0.05)。结论:三百棒醇提物可以通过PI3K/AKT/m TOR通路阻断自噬流,从而抑制MH7A细胞增殖并诱导细胞凋亡。
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