壬基酚(NP)是壬基酚聚氧乙烯醚(NPE)的降解产物,已被证实是一种环境内分泌干扰物(EDCs).研究表明围产期或成年后的NP暴露对男性生殖系统有显著的不利影响,尤其是对雄激素水平。事实上,环境中壬基酚是由不同异构体组成的混合物,不同结构壬基酚同分异构体的雌激素活性存在差异。然而,关于壬基酚同分异构体单体的研究却少之又少。本课题检测了壬基酚经口摄入后在睾丸组织的分布、清除与富集,并成功分离睾丸间质细胞,系统地研究了壬基酚对原代培养大鼠睾丸间质细胞分泌睾酮的影响；同时,进一步对比研究了高纯度壬基酚同分异构体对原代培养大鼠睾丸间质细胞分泌睾酮的影响差异。第一部分：壬基酚经口摄入后在雄性大鼠体内的分布与富集一、目的了解壬基酚经口摄入后在雄性大鼠体内的分布与富集。二、方法1.对自由进食大鼠一次灌胃14C-4-NP111(500mg/kg)后,不同时间点(0、0.5、1、2、4、8、12、24、48、72、96h)处死动物,取血、肝、肾、睾丸和脑组织测定壬基酚含量。2.对自由进食大鼠灌胃14C-4-NP111(50mg/kg),分别持续一天、一周、一月后才处死动物,取血、肝、肾、睾丸和脑组织测定壬基酚含量。三、结果1.自由摄食大鼠灌胃14C-4-NP111(500mg/kg)后,在血、肝脏、肾脏、睾丸和脑组织中的清除符合一室模型,其平均滞留时间分别为42.65、44.32、37.58、49.67和43.51h。2.自由进食大鼠持续灌胃14C-4-NP111(50mg/kg)一天、一周、一月后,血、肝脏、肾脏和脑组织中壬基酚的含量随时间虽有所增加,但增幅不大,而睾丸中壬基酚的含量随时间增加明显。四、结论壬基酚经口摄入后,在大鼠睾丸组织有明显分布,滞留时间较长,且有明显的富集效应。第二部分大鼠睾丸间质细胞的原代培养、鉴定与功能监测一、目的采用改良方法对大鼠睾丸间质细胞进行分离、.纯化和原代培养,以得到更高纯度和稳定的间质细胞原代培养体系。二、方法1.采用酶消化法分离大鼠睾丸间质细胞,再用Percoll连续密度梯度离心除去生精细胞、支持细胞等杂细胞,实现进一步纯化；2.用3β-HSD特异性染色法鉴定间质细胞纯度；3.采用放射免疫法测定间质细胞睾酮分泌的活性。三、结果1.培养的间质细胞纯度达到95%以上,每个睾丸可获取间质细胞约1×106个；2.通过3β-HSD特异性染色鉴定,该间质细胞胞质呈蓝黑色,而且细胞具有分泌睾酮的活性。四、结论1.酶消化后以Percoll连续密度梯度离心可分离得到高纯度的睾丸间质细胞；2.用该法分离得到的间质细胞具有较好的睾酮分泌活性。第三部分壬基酚对原代培养大鼠睾丸间质细胞的影响一、目的探讨壬基酚(NP)对大鼠睾丸间质细胞分泌雄激素的影响。二、方法1.体外分离、培养睾丸间质细胞,并采用3β-HSD染色对间质细胞进行鉴定；2.以不同浓度的NP(分别为较低浓度0.005、0.015、0.025。0.05。0.1及稍高浓度0.5、5.0、10.0、15.0、25.0μmol/L)作用于间质细胞48h；3.采用3β-HSD染色观察间质细胞形态的变化,并检测间质细胞分泌睾酮含量的变化。三、结果1.间质细胞经NP处理后,细胞形态发生变化,细胞密度降低,NP作用浓度达到25μmol/L时,细胞发生裂解。2.0.005及0.015μmol/L NP处理后,间质细胞睾酮分泌量增加,与对照组比较差异有显著性(P<0.05)。NP浓度达到0.5μmol/L后,睾酮分泌量与对照组相比显著下降(P<0.05),且当NP浓度为5、10、15、25μmol/L时睾酮分泌量下降极为明显(P<0.01)。四、结论低浓度NP能促进间质细胞分泌睾酮,而高浓度NP抑制睾酮分泌,且高浓度NP能诱导间质细胞坏死。第四部分不同壬基酚同分异构体对原代培养大鼠睾丸间质细胞的影响一、目的作为分布广泛的环境内分泌干扰物,NP在一定浓度下对野生动物和人类的生殖功能具有明确的负面影响。工业壬基酚是由不同异构体组成的混合物,不同结构壬基酚同分异构体的雌激素活性存在差异。然而,以往进行的壬基酚雌激素效应研究多以工业壬基酚为研究对象,很少以单一的壬基酚同分异构体作为受试化合物。本研究目的是评价不同壬基酚同分异构体对原代培养大鼠睾丸间质细胞分泌睾酮的影响。二、方法1.体外分离、培养睾丸间质细胞,并采用3β-HSD染色对间质细胞进行鉴定；2.筛选最适的药物作用浓度：NP浓度达到0.5后,NP对睾酮分泌有明显抑制作用。以不同浓度(分别为1.0、5.0、10.0、20.0μmol/L)的雌二醇(E2)、工业壬基酚(t-NP)、直链壬基酚(4n-NP)及壬基酚同分异构体(p33-NP、262-NP. p353-NP、363-NP)作用于原代培养的睾丸间质细胞6h,检测间质细胞分泌睾酮量的变化及细胞活力来筛选最适的药物作用浓度。3.最适的药物浓度下,E2、t-NP、4n-NP、p33-NP及p363-NP作用于原代培养的睾丸间质细胞6h,通过RT-PCR、Western blot技术分别从mRNA和蛋白水平检测睾酮合成过程关键蛋白3β-HSD、Cyp11a1、Star的表达水平,通过TUNEL技术检测暴露不同NP同分异构体对原代培养间质细胞凋亡水平的影响。三、结果1.筛选最适的药物作用浓度：浓度≥5.0μmol/L时,工业壬基酚(t-NP)、直链壬基酚(4n-NP)及壬基酚同分异构体(p33-NP、p262-NP、353-NP、p363-NP)对间质细胞睾酮分泌开始表现出有统计学意义的抑制作用；然而,浓度≥10.0μmol/L时,间质细胞活力会受到明显影响。为此,选择5.0μmol/L作为最适的药物作用浓度。2.5.0μmol/L E2、t-NP、4n-NP、p33-NP、p262-NP、p353-NP及p363-NP作用下,间质细胞睾酮分泌均受到明显抑制(P<0.01),而不同NP同分异构体的抑制程度彼此间有统计学差异,其中p363-NP的抑制作用最强。3.5.0μmol/LE2、t-NP、4n-NP、353-NP及363-NP作用下,间质细胞3β-HSD、 Cypllal、Star的表达在mRNA水平上均有不同程度下降,蛋白水平上与之一致。同时,不同NP同分异构体的对3β-HSD、Cyplla1、Star表达的抑制程度彼此不同,且更有偏重。4.5.0μmol/L E2、t-NP、4n-NP、p33-NP、p262-NP、p353-NP及p363-NP作用下,间质细胞凋亡水平上升。不同NP同分异构体作用程度彼此间存在差异,p353-NP作用最弱,p33-NP、p262-NP、p363-NP作用相当。四、结论1.较高浓度(≥5.0μmol/L)的NP同分异构体对原代培养大鼠睾丸间质细胞分泌睾酮有抑制作用。然而,不同NP同分异构体的抑制程度彼此间存在差异,这种差异可能源于不同NP同分异构体对3β-HSD、Cyplla1、Star表达水平和间质细胞凋亡水平的影响程度不同。2.NP同分异构体对睾丸间质细胞分泌睾酮的抑制程度与其体外雌激素活性并不完全一致,这提示可能还存在其他机制参与这一抑制作用。本研究的特色与创新之处：1.本课题检测了NP经口摄入后,首次证明了其在睾丸组织内存在,并探讨了NP在动物体内不同器官的分布,了解了对NP在体内的清除及富集过程。2、成功分离、纯化、培养了大鼠原代睾丸间质细胞,系统地研究了壬基酚对原代培养大鼠睾丸间质细胞分泌睾酮的影响；2.率先探讨了NP的不同同分异构体对原代培养大鼠睾丸间质细胞分泌睾酮的影响差异。