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桂枝汤(由桂枝、芍药、甘草、生姜、大枣组成)是治疗太阳中风的主方，能解肌发表，调和营卫，用于外感风寒表虚证。前期的研究工作证明，桂枝汤对体温有双向调节作用，对相关的多条细胞内信号转导通路有影响。本所化学室对桂枝汤进行了提取分离，获得了有效部位A(Fr.A)。进一步的药理实验证明Fr.A与其全方一样，通过影响发热信号传导通路上酶的活性和水平，对体温有双向调节作用。Fr.A中含有分子量小于1000的，约50个不同对应主要分子量的指纹峰，其中可能的已知物质约25个，分别来自全方5个组成药味。 本研究论文以前列腺素E2(PGE2)中枢致热的信号转导通路为主线，以原代培养的脑微血管内皮细胞(rCMEC)为研究对象，探讨Fr.A中分离获得的6个苯丙烯类成分桂皮醛、邻甲氧基桂皮醛、桂皮醇、邻甲氧基桂皮醇、桂皮酸及邻甲氧基桂皮酸对IL-1β刺激的rCMEC内PGE2合成代谢主要靶点的影响；同时考察6个苯丙烯类成分联合用药后对PGE2合成代谢主要靶点的影响，用等效线法进行联合用药性质的判断。以双向电泳技术(2-D)为技术平台，通过观察差异蛋白质点的变化，以期进一步揭示方剂的整合作用。进行了以下实验，其研究结果简单概括如下： 一、Fr.A苯丙烯类成分对IL-1β刺激的rCMECp-p38MAPK蛋白相对表达水平的影响以30ng/ml的IL-1β刺激rCMEC0.5、1、2、4、8、12、24h，4h细胞内p-p38MAPK蛋白相对表达水平至峰值，8h有所降低，呈时间依赖关系。以10、20、30、40、50ng/ml的IL-1β刺激rCMEC12h后，细胞内p-p38MAPK蛋白相对表达水平均显著增高，并呈浓度依赖关系。 分别给予桂枝汤有效部位A中6个苯丙烯类成分后，以30ng/mlIL-1β刺激rCMEC4h，观察细胞内p-p38MAPK相对表达水平。实验结果显示，桂皮醛、邻甲氧基桂皮醛，桂皮醇、邻甲氧基桂皮醇，桂皮酸、邻甲氧基桂皮酸抑制内皮细胞p-p-38MAPK蛋白相对表达量的IC50分别为：154.82、210.64、67.60、270.02、596.94、1003.29μg/ml。 二、Fr.A苯丙烯类成分对IL-1β刺激的rCMECsPLA2活性的影响以30ng/ml的IL-1β刺激rCMEC0.5、1、2、4、8、12、24h，4h细胞内sPLA2活性至峰值，8h有所降低，呈时间依赖关系。以10、20、30、40、50ng/ml的IL-1β刺激rCMEC4h后，sPLA2活性均显著增高，并呈浓度依赖关系。分别给予桂枝汤有效部位A中6个苯丙烯类成分后，以30ng/mlL-1β刺激rCMEC4h，测定细胞外液中sPLA2活性。实验结果提示，桂皮醛、邻甲氧基桂皮醛、桂皮醇、邻甲氧基桂皮醇、桂皮酸及邻甲氧基桂皮酸抑制内皮细胞外液sPLA2活性的IC50分别为：235.99、123.35、213.10、425.31、154.86、468.65μg/ml。 三、Fr.A苯丙烯类成分对IL-1β刺激的rCMECcPLA2活性的影响以30ng/ml的IL-1β刺激rCMEC0.5、1、2、4、8、12、24h，12h细胞内cPLA2活性至峰值，24h有所降低，呈时间依赖关系。以10、20、30、40、50ng/ml的IL-1β刺激rCMEC12h后，细胞内cPLA2活性均显著增高，并呈浓度依赖关系。 分别给予桂枝汤有效部位A中6个苯丙烯类成分后，以30ng/mlIL-1β刺激rCMEC12h后，检测细胞内cPLA2活性。本实验结果显示，桂皮醛、邻甲氧基桂皮醛、桂皮醇、邻甲氧基桂皮醇、桂皮酸及邻甲氧基桂皮酸内皮细胞cPLA2活性的IC50分别为：36.44、91.67、65.27、75.60、699.80、342.67μg/ml。 四、Fr.A苯丙烯类成分对IL-1β刺激的rCMECCOXmRNA的影响以30ng/ml的IL-1β刺激rCMEC0.5、1、2、4、8、12、24h，1h可检测到细胞内COX-2mRNA相对表达，4h至峰值，8h有所降低，12及24h未检测到COX-2mRNA表达；COX-1mRTA相对表达无明显变化。以10、20、30、40、50ng/ml的IL-1β刺激rCMEC4h后，细胞内COX-2mRNA相对表达增高，呈浓度依赖关系；COX-1mRNA相对表达无明显变化。 分别给予桂枝汤有效部位A中6个苯丙烯类成分后，以30ng/mlIL-1β刺激rCMEC4h，检测细胞内COX-2mRNA相对表达情况。本实验结果显示，桂皮醛、邻甲氧基桂皮醛、桂皮醇、邻甲氧基桂皮醇、桂皮酸及邻甲氧基桂皮酸抑制内皮细胞COX-2mRNA相对表达的IC50分别为：22189.00、545.34、131.79、277.11、3737.71、12181.88μg/ml。 五、Fr.A苯丙烯类成分对IL-1β刺激的rCMECCOX活性的影响以30ng/ml的IL-1β刺激rCMEC0.5、1、2、4、8、12、24h，细胞内COX-2活性逐渐增高，12h至峰值，24h有所降低，呈时间依赖关系；COX-1活性无明显变化。以10、20、30、40、50ng/ml的IL-1β刺激脑微血管内皮细胞12h后，细胞内COX-2活性均显著增高，并呈浓度依赖关系；COX-1活性无明显变化。 分别给予桂枝汤有效部位A中6个苯丙烯类成分后，以30ng/mlIL-1β刺激rCMEC12h，检测细胞内COX-2活性。本实验结果显示，桂皮醛、邻甲氧基桂皮醛、桂皮醇、邻甲氧基桂皮醇、桂皮酸及邻甲氧基桂皮酸抑制内皮细胞COX-2活性的IC50分别为：77.88、137.16、115.44、95.70、2387.82、18886.55μg/ml。 六、Fr.A苯丙烯类成分对IL-1β刺激的rCMEC15-PGDH活性的影响以30ng/ml的IL-1β刺激rCMEC0.5、1、2、4、8、12、24h，12h细胞内15-PGDH活性至峰值，24h有所降低，呈时间依赖关系。以10、20、30、40、50ng/ml的IL-1β刺激rCMEC12h后，细胞内15-PGDH活性均显著增高，并呈浓度依赖关系。 分别给予桂枝汤有效部位A中6个苯丙烯类成分后，以30ng/mlIL-1β刺激脑微血管内皮细胞12h，检测细胞内15-PGDH活性。本实验结果显示，桂皮醛、邻甲氧基桂皮醛、桂皮醇、邻甲氧基桂皮醇、桂皮酸及邻甲氧基桂皮酸抑制内皮细胞15-PGDH活性的IC50分别为：61.19、250.87、31.68、2089.87、149.20、30.14μg/ml。 七、Fr.A苯丙烯类成分对IL-1β刺激的rCMECPGE2分泌的影响以30ng/ml的IL-1β刺激rCMEC0.5、1、2、4、8、12、24h，细胞培养液中PGE2含量逐渐增多，12h至峰值，24h有所降低，呈时间依赖关系。以10、20、30、40、50ng/ml的IL-1β刺激rCMEC12h后，细胞外液中PGE2含量均显著增多，并呈浓度依赖关系。 分别给予桂枝汤有效部位A中6个苯丙烯类成分后，以30ng/mlIL-1β刺激脑微血管内皮细胞12h，检测细胞外液中PGE2含量。本实验结果显示，桂皮醛、邻甲氧基桂皮醛、桂皮醇、邻甲氧基桂皮醇、桂皮酸及邻甲氧基桂皮酸抑制内皮细胞PGE2释放的IC50分别为：50.22、55.66、58.77、120.01、300.81、1431.54μg/ml。 八、Fr.A苯丙烯类成分联合应用后对PGE2合成代谢主要靶点的影响根据桂枝汤有效部位A中分离获得的6个苯丙烯类成分比例联合用药，探讨其对PGE2合成代谢主要靶点的影响，以等效线法进行联合用药性质的判断。首先求得6药联用后对p-p38MAPK蛋白相对表达水平、sPLA2活性、cPLA2活性、COX-2mRNA、COX-2活性、15-PGDH活性的IC50分别为100.32、277.13、72.57、280.13、76.52、92.02、48.79μg/ml。以等效线法公式，计算联合用药后对p-p38MAPK蛋白相对表达、sPLA2、cPLA2、COX-2mRNA、COX-2活性、15-PGDH活性的作用性质。求得q值分别为0.87、1.25、1.68、0.61、0.87、1.84，表明6药联合给药后对p-p38MAPK蛋白表达为协同作用、对sPLA2活性为拮抗作用、对cPLA2活性为拮抗作用、对COX-2mRNA为协同作用、对COX-2活性为协同作用、对15-PGDH活性为拮抗作用。对PGE2释放的影响，联合给药后的q值为0.92，表明药物联用的终末效应为协同作用。 九、Fr.A苯丙烯类成分及其联用后对IL-1β刺激的rCMEC蛋白组学影响PGE2是重要的中枢发热介质，而IL-1β作为内生致热原的一种可以刺激rCMECPGE2的合成和/或释放，从而介导引起体温调节中枢的活动。通过双向电泳技术分离正常、IL-1β刺激rCMEC蛋白质组，得到31个差异蛋白质点，其中下调的22个，上调的9个，共约占所有可辨识蛋白质点的3﹪。给予桂枝汤苯丙烯类成分桂皮醛、邻甲氧基桂皮醛，桂皮醇、邻甲氧基桂皮醇，桂皮酸、邻甲氧基桂皮酸及6药联合应用后，31个差异蛋白质点中有11个蛋白质点的相对含量出现变化，提示这些差异蛋白质点可能是Fr.A解热作用的主要靶点。