论文部分内容阅读
急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)指各种原因引起的肾功能快速下降而出现的临床综合征。2013年我国一项大样本多中心的流行病学调查显示AKI发病率11.6%,其中社区获得AKI的发病率为2.5%,住院期间获得AKI的发病率为9.1%,住院患者AKI病死率高达8.8%,已然成为目前危害人类健康的重要公共问题[1]。随着近年来发病率越来越高,尽管肾病学界对AKI日趋重视,但目前仍无特异治疗,死亡率高,是肾脏病中的急危重症。AKI病理生理过程较为复杂:包括凋亡、坏死、活性氧产生、以及微血管损伤引起的局部缺血、内皮细胞功能紊乱、炎症因子的释放,肾小管细胞的损伤坏死是AKI的主要的病理过程。保护肾小管细胞免受损伤是阻断AKI发生和进展的关键所在。因此如何预防及治疗肾小管上皮细胞损伤是目前治疗AKI面临的难题。自噬可以清除降解细胞内受损的细胞结构和衰老的细胞器以及不再需要的生物大分子,对终末分化细胞的生长和发育起重要作用,在消化的同时,也为细胞内细胞器的构建提供原料,即细胞结构的再循环。1983年,Berkenstam等[2]首次从大鼠肾脏皮质中分离出自噬性囊泡。一些研究已证实自噬在肾小管上皮细胞损伤中发挥保护作用[3,4]。机体可以通过自噬途径清除细胞内损伤或衰老的细胞器和生物大分子,选择性自噬包括线粒体自噬(mitophagy)、过氧化物酶体自噬(pexophagy)、脂质自噬(lipophagy)、聚合蛋白自噬(aggrephagy)、内质网自噬(ER-phagy)、核糖体自噬(ribophagy)、病原微生物自噬(xenophagy)、纤毛自噬(ciliophagy)等,以维持机体正常生理功能[5-7]。在神经系统、肿瘤疾病中线粒体自噬备受关注,泛素蛋白酶体系统通过线粒体膜电位的减少以及线粒体形态学的变化从而识别受损的线粒体,进行线粒体自噬。ATP以及线粒体活性氧的产生能够调节线粒体自噬[8]。因此有必要探讨在肾脏疾病中线粒体自噬与线粒体功能的关系。我们设想线粒体自噬将受损的线粒体清除,进一步改善线粒体功能,从而缓解细胞损伤。因此通过自噬及线粒体自噬的抑制与激活从两方面在顺铂导致的肾小管上皮细胞损伤模型中验证以上假说。有学者对临床患者的血液mRNA水平进行研究发现,糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)和糖尿病非肾病患者的线粒体自噬指标pink1-parkin水平明显低于健康对照者,认为存在线粒体自噬不足[9]。而Pink1-Parkin是否也参与顺铂导致的肾小管上皮细胞损伤,并且其在肾小管上皮细胞中与线粒体功能的联系也未见报道,我们在本研究中通过siRNA干扰以及质粒过表达对其进行初步探讨。第一部分线粒体自噬在顺铂导致的肾小管上皮细胞损伤中的作用目的:探讨线粒体自噬与线粒体功能在顺铂导致的肾小管上皮细胞损伤中的作用。方法:体外培养人肾小管上皮细胞(HK-2),以不同浓度(0、5、10、20umol/L)处理HK-2细胞12h,Western blot检测自噬相关蛋白Beclin、LC3,电子显微镜观察自噬体结构。雷帕霉素(Rap,100nmol/L)或3-甲基腺嘌呤(3-MA,5mmol/L)预先30min加药,与顺铂(10umol/L)共处理肾小管上皮细胞12h后,Western blot检测自噬相关蛋白Beclin、LC3,预先转染自噬腺病毒(mRFP-GFP-LC3)12h后共聚焦显微镜观察自噬体的表达,mitotracker与lysotracker共染观察线粒体自噬的表达。测定活性氧(ROS)、线粒体活性氧(MitoSOX)、线粒体膜电位(JC-1)、检测ATP含量。CCK-8检测细胞增殖活力,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果:(1)随着顺铂刺激浓度增加,Beclin、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表达逐渐升高。电子显微镜观察到典型自噬体双层膜结构。(2)3-MA预先处理HK-2后,与顺铂共处理,较顺铂组Beclin、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达降低,mRFP-GFP-LC3转染自噬体数目减少,mitotracker与lysotracker共染重合斑点数目减少,ROS、MitoSOX荧光增强,JC-1红色荧光表达减弱、绿色荧光表达增强,ATP的含量减少。细胞凋亡增加,CCK-8测定细胞活力降低(P<0.05)。(3)Rap预先处理HK-2后,与顺铂共处理,较顺铂组Beclin、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表达增强,mRFP-GFP-LC3转染自噬体数目增多,mitotracker与lysotracker共染重合斑点数目增加,ROS、MitoSOX荧光表达减弱,JC-1红色荧光表达增强、绿色荧光表达减弱,ATP的含量增强,细胞凋亡减少,CCK-8测定细胞活力增高(P<0.05)。结论:顺铂可诱导肾小管上皮细胞自噬及线粒体自噬,促进线粒体自噬能够保护线粒体功能进而减轻顺铂导致的肾小管上皮细胞损伤,抑制线粒体自噬损伤线粒体功能进一步加重顺铂导致的肾小管上皮细胞损伤。第二部分 Pink1-Parkin调控线粒体自噬在顺铂导致的肾小管细胞损伤中的作用目的:探讨Pink1-Parkin调控线粒体自噬在顺铂导致的HK-2细胞损伤及线粒体功能障碍中的保护作用。方法:体外培养HK-2细胞,研究顺铂的剂量效应(0、5、10、20umol/L),应用Western blot检测Pink1、Parkin蛋白的表达。进一步运用siRNA干扰技术,HK-2细胞瞬时转染Pink1siRNA和Parkin siRNA,另外脂质体转染Pink1、Parkin过表达质粒,顺铂刺激HK-2细胞,Western blot检测Beclin、LC3、Pink1、Parkin蛋白的表达,测定细胞内ROS、线粒体膜电位(JC-1)、检测ATP含量。CCK-8检测细胞活力。结果:(1)随着顺铂刺激浓度增加,Pink1、Parkin的表达逐渐升高。(2)HK-2细胞瞬时转染Pink1 siRNA和Parkin siRNA,与顺铂共处理,较顺铂组Beclin、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Pink1、Parkin的表达降低,JC-1红色荧光表达减弱、绿色荧光表达增强,ATP的含量减少。CCK-8测定细胞活力减少(P<0.05)。(3)Pink1、Parkin过表达质粒预先转染HK-2后,顺铂刺激HK-2细胞,较顺铂组Beclin、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Pink1、Parkin的表达增强,JC-1红色荧光表达增强、绿色荧光表达减弱,ATP的含量增强,细胞凋亡减少,CCK-8测定细胞活力增高(P<0.05)。结论:顺铂诱导Pink1、Parkin表达增加,Pink1/Parkin调控线粒体自噬在顺铂导致的HK-2细胞损伤及线粒体功能障碍中起保护作用。