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滞育是昆虫在面临即将到来的恶劣环境时,为了生存并适应这一环境而形成的特定生理状态,最明显的特征就是发育极其缓慢、代谢活性下调和抗逆性增强。目前普遍认为,不同虫态的滞育是受不同激素的调节,如棉铃虫的蛹滞育就是因脑分泌的促前胸腺激素（PTTH）下调,引起前胸腺（PG）合成分泌的蜕皮激素（ecdysone）的减少,导致了蛹滞育。滞育的发生是一个复杂的生理过程,需要许多信号通路参与其中,如胰岛素信号通路和TGF-β信号通路等。有文献报道aPKC受TGFβRI调控,进而调控生物体的生长代谢,但其具体的作用机制尚不完全清楚。因此,本文旨在研究胰岛素信号通路和TGFβRI-aPKC信号通路在棉铃虫蛹滞育中的作用机制,以期阐述滞育发生的分子事件。在哺乳动物中,胰岛素信号通路有两条经典的通路,Insulin激活胰岛素受体（InR）,然后InR激活胰岛素受体底物（IRS）,从而激活两条主要的通路:1)通过磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）激活蛋白激酶B（PKB/Akt）,Akt再调节下游靶标蛋白,如FOXO等;2)通过Ras调控细胞生长分化的有丝分裂原激活的蛋白激酶（MAPK）信号路径,其中以MAPK亚族中的细胞外调节蛋白激酶（ERK）研究最为常见。前期研究工作已经证明棉铃虫蛹脑中的p-Akt和p-ERK表达都是滞育型显著高于非滞育型,是由活性氧（ROS）通过调控InR引起的,那么InR又是如何调控p-Akt和p-ERK?高表达的p-Akt和p-ERK发挥什么作用?为此,我们克隆了p-Akt和p-ERK上游的关键节点蛋白IRS,调查了p-IRS在蛹脑中的蛋白表达变化,显示p-IRS在滞育型棉铃虫蛹脑的表达高于非滞育型,与p-Akt和p-ERK表达模式相似;细胞中过表达IRS,p-Akt和p-ERK上调;干扰IRS后,p-Akt和p-ERK下调,说明p-Akt和p-ERK受p-IRS调控。前期的结果证明InR的磷酸化水平也是在滞育型蛹脑高于非滞育型,那么p-IRS是否受p-InR的调控而实现调节p-Akt和p-ERK?因此,对蛹体注射了InR的抑制剂,发现p-InR、p-IRS、p-Akt和p-ERK下调,证明p-IRS被p-InR调控。过去的结果证明了在滞育型蛹脑中高表达的p-InR是由ROS引起,并且ROS在滞育蛹脑中的水平明显高于非滞育型蛹脑,那么p-IRS是否受ROS的调控呢?用H2O2处理细胞和活体注射活性氧的激活剂PQ后增强氧化压力,结果发现均可以提高p-InR、p-IRS、p-Akt和p-ERK水平;注射PQ的同时,注射ROS清除剂NAC,和单独注射PQ相比,可以引起p-InR、p-IRS、p-Akt和p-ERK下调,说明p-InR、p-IRS、p-Akt和p-ERK在滞育蛹脑中的高表达是由ROS引起的。P-Akt和p-ERK在滞育蛹脑中高表达有什么作用呢?有报道ERK与泛素化有关,因此在细胞水平过表达IRS和ERK,发现总泛素化水平均上调;说明p-ERK在滞育蛹脑中高表达很可能是通过泛素系统降解代谢相关的蛋白,进而实现低代谢状态,减缓发育。结合实验室的前期研究,p-Akt在滞育蛹脑中高表达是促进葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）的上调,达到转运葡萄糖的作用。棉铃虫蛹滞育的一个重要特点就是代谢活性下调,而磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）是糖代谢中调节丙酮酸合成的重要代谢酶。TGF-β信号通路可调控生物体代谢,有研究报道TGFβRI调控aPKC,而aPKC影响代谢酶PEPCK的表达,是否TGFβRI通过aPKC调控代谢酶PEPCK?首先调查了TGFβRI、aPKC和PEPCK蛋白表达时相,发现TGFβRI、aPKC、p-aPKC和PEPCK均在非滞育型蛹脑高于滞育型蛹脑;细胞水平过表达TGFβRI,p-aPKC和PEPCK上调;干扰aPKC或抑制剂（G6983）处理,PEPCK均下调;蛹体分别注射TGFβRI抑制剂（SB431542）或aPKC抑制剂（G6983）,均下调p-aPKC和PEPCK水平;同时注射TGFβRI和aPKC抑制剂可以延迟棉铃虫蛹发育。综上,说明TGFβRI通过aPKC调节代谢酶PEPCK的活性来调节棉铃虫蛹发育。FOXO作为胰岛素通路终端调控的转录因子,在发育调节中有着重要的作用。为此,我们找到了FOXO的下游蛋白P21,P21通过调控CDK2-CyclinE的活性来影响细胞周期。棉铃虫滞育型蛹脑和非滞育蛹脑的形态大小相差较大,非滞育型蛹脑在化蛹4天后明显变大。结合这一表型,我们推测是否FOXO通过P21调控周期蛋白CDK2-CyclinE的活性来调控细胞周期,导致了滞育型和非滞育个体蛹脑的差异?调查发现FOXO总蛋白和P21 mRNA水平均在滞育型蛹脑中高表达;过表达FOXO,P21 mRNA水平明显上调;蛹体注射FOXO抑制剂,P21 mRNA水平明显下调,而CDK2和CyclinE在滞育型蛹脑中低表达;MTT实验测细胞活性发现,转染FOXO和P21确实也可以抑制细胞活性。因此我们推测FOXO可能通过上调P21来抑制周期蛋白CDK2-CyclinE的活性来实现对细胞周期的调控,影响昆虫脑的发育和分化。综上所述,本篇论文研究了胰岛素信号通路和TGFβRI-αPKC信号通路在棉铃虫蛹滞育中的作用机制,研究发现ROS通过p-InR激活p-IRS,p-IRS进一步激活p-Akt和p-ERK水平,从而显著增强其在滞育型蛹脑中磷酸化水平。p-ERK影响泛素化水平,p-ERK在滞育型蛹脑中高表达,可能通过激活泛素化,降解蛋白,进而实现低水平的代谢状态,从而减缓发育。研究还进一步发现,TGFβRI能够通过激活αPKC从而调控代谢酶PEPCK的表达,来调节棉铃虫的基础代谢水平,从而影响蛹滞育。最后,发现FOXO通过P21可能调控细胞周期蛋白CDK2-CyclinE的活性,从而影响细胞周期,最终可能影响滞育期蛹脑的发育。