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猪被认为是流感病毒的基因混合器,人流感和禽流感病毒都可以感染猪,并可在猪中发生基因重配产生新病毒。欧亚类禽H1N1猪流感病毒（Eurasian avian-like H1N1 swine influenza viruses,EA H1N1 SIVs）于 1979 年 1 月首次在欧洲发现,随后逐渐在欧洲和亚洲地区猪群中流行,同时EA H1N1 SIVs不断与其它在猪群中共同流行的流感病毒发生重配,包括2009年甲型H1N1流感（2009 pandemic H1N1,A（H1N1）pdm09）、经典猪流感病毒（Classical swine H1N1,CS H1N1）和三源重配 H1N2 流感病毒（Triple reassortment H1N2,TR H1N2）,从而产生了多种基因型病毒。我国于2001年首次从香港的猪群中分离到EA H1N1 SIV,经过长期的进化,我国猪群中流行的EA H1N1 SIVs更加倾向于结合人α-2,6半乳糖苷唾液酸受体,部分病毒还可以在雪貂中经呼吸道飞沫有效传播,因此,欧亚类禽H1N1猪流感病毒被认为是引起下一次流感大流行可能性最大的动物流感病毒。本研究首先系统分析了我国EA H1N1 SIVs的流行、基因多样性和关键分子标记。研究发现,2001-2018年,我国从19个省市的猪或者感染病例中分离到的EA H1N1 SIVs可分为11个基因型（基因型1～基因型11）。其中基因型1占55.3%,该基因型病毒的8个基因节段均来自于早期的EA H1N1病毒;基因型2～11 分别由 EA H1N1、A（H1N1）pdm09 和 TRH1N2 病毒重配产生。2001-2013年,基因型1广泛流行;2009-2013年,基因型1、2和4共同流行;自2013年起,基因型3和5病毒逐渐成为主要的基因型。广东省检测到的基因型最多,共有7种基因型病毒。分子标记分析表明,含有HA-190D和HA-225E（H3编码）的EA H1N1 SIVs分别占85.9%和84.1%,表明我国猪群中流行的大多数EA H1N1病毒更倾向于结合人α-2,6半乳糖苷唾液酸受体。EA H1N1 SIVs在猪群的流行过程中偶尔会发生跨种传播感染人。201 1年,江苏省报告我国第一例人感染EAH1N1 SVs[A/Jiangsu/1/2011（JS1）],该病毒的8基因片段全部来自于EAH1N1 SIVs,属于基因型1病毒。2015年,在湖南省人感染欧亚类禽H1N1猪流感病毒病例中分离到新的三源重配EA H1N1 SIVs,A/Hunan/42443/2015（HuN）,其中 HA、NA 和 M 基因来自于 EA H1N1 SIVs,PB2、PB1、PA 和 NP 基因来自于 A（H1N1）pdm09,NS 基因来自于 TR H1N2 SIVs,该病毒属于基因型3病毒。我们前期的研究发现基因型3（HuN-like）病毒在小鼠中的致病力明显高于基因型1病毒（JS1-like）,但是具体致病机制尚不清楚。为了阐明两种基因型病毒在小鼠中致病力差异的分子机制,我们首先将HuN和JS1病毒的基因片段进行重配,得到不同的重配病毒。通过小鼠实验发现,NP基因是决定EA H1N1 SIVs在小鼠中致病力的重要因素。进一步对NP基因序列进行分析发现,HuN-like病毒和JS1-like病毒在NP基因上存在三个具有种属特异性的氨基酸差异,分别是R305K、F313V和Q357K。为了确定NP-R305K、F313V和Q357K对小鼠致病力的影响,我们以HuN病毒为骨架引入相应突变,感染小鼠后发现,当HuN病毒引入NP-K357Q突变后,EAH1N1 SIVs在小鼠中的感染力、复制力和毒力均显著下降,同时,NP-K357Q突变也降低了病毒在细胞上的聚合酶活性和复制滴度。因此,NP-Q357K是决定HuN-like和JS1-like病毒在小鼠中致病力不同的关键氨基酸。前期研究发现PB2-E627K、D701N和T271A突变是影响H5N1和H7N9流感病毒致病力的关键分子标记。在JS1-like和HuN-like病毒中,PB2基因的627位氨基酸均为E,701位氨基酸分别为N和D,271位点的氨基酸分别为T和A。之前的研究发现PB2-D701N突变增强了 EAH1N1流感病毒在小鼠中的致病力,但是PB2-T271A突变对EA H1N1 SIVs致病力的影响还未见报道。我们的研究发现PB2-T271A突变显著增加了病毒在A549、PK15和DF-1细胞上的复制能力,以及在小鼠中的致病力。说明PB2-T271A突变也是影响EAH1N1 SIV在小鼠中致病力的重要分子标记。综上所述,本研究系统分析了 2001年以来,我国EA H1N1 SIVs的进化和关键分子标记,发现基因型3和5目前是我国猪群中主要流行病毒;NP基因是决定EA H1N1 SIVs在小鼠中致病力的重要因素,NP-Q357K作为一种新影响EA H1N1 SIV在小鼠中致病力的重要分子标记;PB2-T271A突变也显著增加了 EA H1N1 SIVs在小鼠中的致病力。这些结果为EA H1N1 SIVs的风险评估和精准监测提供了科学依据。