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[目的]何首乌始载于宋代《开宝本草》,药用历史悠久。何首乌及其种下类群的分类一直存在争议,何首乌中特有的化学成分及指标性成分二苯乙烯苷在不同产地中的含量存在明显差异,该差异是否与形态特征、基因突变有关尚不清楚。本文旨在解决以下几个问题:(1)阐明何首乌与其变种棱枝何首乌、毛脉蓼之间的分类关系,为何首乌的种质资源提供依据;(2)建立一种快速且有效鉴别何首乌真伪的方法,以鉴别市场上何首乌及其近缘种;(3)初步阐明何首乌块根中二苯乙烯苷含量与化学多样性间的关系,为何首乌的质量评价、种质资源及临床应用提供依据。[方法](1)对何首乌Fallopia multiflora(Thunberg)Haraldson、棱枝何首乌Fallopia multiflora var.angulata(S.Y.Liu)H.J.Yan,Z.J.Fang&Shi Xiao Yu和毛脉蓼Fallopia multiflora var.ciliinervis(Nakai)Yonekura&H.Ohashi三个种的根或根状茎、茎与叶等营养器官开展性状与显微特征比较研究;应用HPLC-DAD法对何首乌中11种化合物(儿茶素、虎杖苷、二苯乙烯苷、大黄素、大黄素甲醚、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄酸、大黄酚、芦荟大黄素、槲皮素和白藜芦醇)的含量开展测定并进行主成分分析(PCA)和聚类分析(HCA);运用nr DNA(ITS2序列)和cp DNA(mat K和psb A-trn H序列)构建何首乌、棱枝何首乌和毛脉蓼的NJ、ML和BI系统进化树。(2)根据何首乌、棱枝何首乌、毛脉蓼和齿叶蓼的psb A-trn H序列上的SNP位点,设计特异性引物,进行PCR扩增,并对其PCR反应体系中的DNA模板量、引物量、Mg Cl2浓度、不同类型的PCR聚合酶和PCR扩增条件中的退火温度及循环次数进行考察,建立一种快速的等位基因特异性PCR扩增鉴别方法。(3)在何首乌、棱枝何首乌和毛脉蓼分类鉴别基础上,采用HPLC-DAD-VWD法同时测定何首乌中12种化合物(原花青素B1、儿茶素、顺式-二苯乙烯苷、虎杖苷、二苯乙烯苷、土大黄苷、白藜芦醇、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、芦荟大黄素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚)的含量并结合聚类分析(HCA)对11省71批样品进行比较研究,根据含量差异划分不同的类型。[结果](1)从宏观和微观形态特征分析,何首乌和棱枝何首乌的地下器官为块根,而毛脉蓼的地下器官为根状茎;在系统进化树中,何首乌与棱枝何首乌聚为一支,自展支持率(mat K+psb A-trn H:NJ-BS/ML-BS/BI-PP=99/85/0.99),而毛脉蓼为单独的一支;此外,何首乌、棱枝何首乌和毛脉蓼之间的化学成分也存在明显差异,何首乌块根中含有大量的二苯乙烯苷和蒽醌类化合物,少量的虎杖苷;与何首乌相比,毛脉蓼根状茎中含有大量的虎杖苷和蒽醌类化合物,而不含二苯乙烯苷;在棱枝何首乌块根中,11种化合物的含量均较低;基于主成分分析(PCA)和聚类分析(HCA),毛脉蓼的所有样品聚为一组,何首乌和棱枝何首乌的所有样品聚为一组。(2)通过等位基因特异性PCR扩增技术,建立了一种快速鉴别何首乌特异性PCR的方法,对不同产地何首乌及其近缘种的PCR反应体系及扩增条件进行优化,结果表明特异性PCR产物在模板量为100 ng/m L,Mg Cl2用量为1.5μL,上游引物、下游引物使用量分别为1μL,使用r Taq酶的PCR反应体系及退火温度为48℃,循环次数为30个时的条件为最佳,其能有效鉴别何首乌真伪。(3)11省71批何首乌样品中二苯乙烯苷含量在0.2%~4.9%之间,游离蒽醌(大黄素、大黄素甲醚、芦荟大黄素和大黄酚)含量在0.01%~1.2%之间,其中大黄酚和芦荟大黄素含量非常低,甚至检测不到。根据HCA分析,将何首乌划分为5种类型。A型:二苯乙烯苷含量<1%;B型:二苯乙烯苷含量在1%~2.5%之间;C型:二苯乙烯苷含量在2.5%~3%之间;D型:二苯乙烯苷含量在3%~4.5%之间;E型:二苯乙烯苷含量>4.5%。其中,A型何首乌不符合药典规定。[结论](1)毛脉蓼在形态、化学和分子上与何首乌、棱枝何首乌存在明显差异,应将其视为一个独立的种;棱枝何首乌在形态、化学和分子上与何首乌相似,可视为何首乌的变种。(2)等位基因特异性PCR扩增能快速有效鉴别何首乌及其近缘种,为市场上的何首乌药材鉴别提供方法,临床应用提供依据。(3)何首乌可根据其二苯乙烯苷含量差异可分为不同的化学类型。何首乌中二苯乙烯苷与游离蒽醌间呈现一种规律:二苯乙烯苷含量较高时其游离蒽醌含量相对较低。