前言糖尿病肾病是糖尿病最严重和最常见的慢性微血管并发症之一，也是导致终末期肾衰和糖尿病病人死亡的主要原因之一，因此对其发病机制的探讨一直以来是肾病研究领域的热点之一。2001年，Brownlee研究并提出了高血糖致糖尿病并发症的共同机制学说，这使得人们对糖尿病肾病的发病机制的认识有了突破性的进展：许多与糖尿病肾病发生发展密切相关的因素和环节，如遗传易感、糖脂代谢紊乱、血流动力学异常、多种细胞因子、血管活性物质和化学趋化因子表达过多等都涉及一种重要的共同机制——氧化应激，过量的活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)是高血糖激活多元醇、晚期糖基化终末产物(Advanced Glycation End Products，AGEs)形成、蛋白激酶C(Protein Kinase C，PKC)和己糖胺通路导致肾脏病变的共同介质。肝细胞生长因子(Heaptocyte Growth Factor，HGF)最初是从部分肝切除的大鼠血浆中分离纯化获得的，因能刺激原代培养的肝细胞的生长而得名。然而，随着研究的深入，人们发现HGF通过细胞膜上其特异性受体c-Met对多种细胞都具有促有丝分裂、细胞移动、形态发生、血管形成及抗凋亡等多种生物学作用。由于肾脏是体内c-Met表达最高的器官之一，所以HGF在肾脏生理和病理学中所发挥的作用及意义成为了近十年来HGF研究的焦点之一。大量体内研究证实，HGF作为一种肾营养和保护因子对糖尿病肾病具有显著的防治效果，但其中的机制是否与HGF抑制高糖诱导的氧化应激有关，迄今为止尚无国内外研究报道。阐明这些不仅有助于完善对HGF防治糖尿病肾病作用机制的认识，还能从抗氧化角度进一步明确HGF对肾脏的保护作用及其机理。肾脏系膜细胞(Mesangial cell，MsC)作为肾小球内功能活跃的固有细胞，在生理状态下肾小球正常结构及功能的维持中和病理状态下肾小球炎症及硬化的发生发展中都具有重要的作用。实验表明，ROS作为信号分子通过激活MsC内PKC、丝裂原激活蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinase，MAPK)等信号通路，活化转录因子核因子—κB(Nuclear Factor—κB，NF—κB)、活化蛋白-1(Activator Protein，AP-1)等，使得转化生长因子β1(transforming growth factor betal，TGF-β1)，结缔组织生长因子(Connective Tissue Growth Factor，CTGF)，单核细胞趋化蛋白-1 (Monocyte Chemoattractant Protein-1，MCP-1)，Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制因子(Plasminogen Activator Inhibitor-1，PAI-1)和细胞外基质(Extracellular Matrix，ECM)的表达水平异常上调，而导致肾小球硬化。本课题采用细胞培养、RT-PCR、Western blot、同工酶谱法、流式细胞仪检测以及EMSA等实验方法，从体外角度观察了高糖状态对大鼠MsC HGF受体c-Met表达的影响；HGF对高糖诱导的大鼠MsC内氧化应激的影响，并初步探讨这种作用所涉及的可能的机制，以期明确HGF对高糖刺激下MsC的抗氧化保护作用，探讨HGF作为一种抗氧化因子防治糖尿病肾病的重要意义，为临床治疗糖尿病肾病以及其它肾脏疾病的防治提供新的理论线索和实验依据。第一部分高糖对大鼠肾脏MsC c-Met转录与表达的影响目的探讨高糖(High Glucose，HG)对体外培养的大鼠MsC转录和表达HGF受体c-Met的影响及其机制。方法原代分离、培养大鼠MsC，应用RT-PCR和Western blot的方法分别从mRNA和蛋白水平上检测HG作用不同时间点(0，12，24，48，96h)大鼠MsC表达c-Met的变化。光辉霉素A(Mithramycin A)用以抑制Sp1的活性，采用电泳迁移率改变实验(Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA)观察细胞内Sp1与c-Met基因启动子的结合活性。结果HG组c-Met的mRNA和蛋白表达在12h、24h和48h都显著高于0h对照组，而后在96h下降，其组间差异具有统计学意义(P＜0.05)。与未加入光辉霉素A的HG组比，光辉霉素A呈剂量依赖性抑制HG诱导的大鼠MsC c-Met的mRNA和蛋白表达，差异具有统计学意义(P＜0.05)。与未见明显Sp1探针和Sp1转录因子复合物结合条带的正常糖(normal glucose，NG)浓度组和甘露醇(mannitol，MNT)组相比，HG组出现了明显的Sp1探针结合Sp1转录因子复合物的条带，而在加入光辉霉素A的HG组此条带未出现，差异具有统计学意义(P＜0.05)。小结大鼠MsC c-met的表达在HG作用的12、24和48h后都明显上升，而在96h后下降。光辉霉素A可以呈浓度依赖性地抑制HG作用下大鼠MsC c-Met表达的上调。大鼠MsC内Sp1与c-Met基因启动子的结合活性在HG作用下明显增强。第二部分HGF对高糖诱导的大鼠肾脏MsC内氧化应激的影响目的观察HGF对HG诱导的大鼠肾脏MsC内氧化应激的影响。方法应用RT-PCR和Western blot的方法检测HGF对HG环境下大鼠MsC c-Met表达的影响。采用双氢-乙酰乙酸二氯荧光黄(DCFH-DA)捕获细胞内ROS，应用流式细胞仪和荧光显微镜检测细胞内ROS生成的情况；应用分光光度法检测细胞内谷胱甘肽(Glutathione，GSH)和丙二醛(Malonaldehyde，MDA)的含量。MsC内抗氧化酶的mRNA表达及其活性情况分别采用RT-PCR和分光光度法检测。结果HG组和HG+HGF组c-Met的mRNA和蛋白表达水平都显著增高，但两者无显著差异。与NG+HGF组相比，HG+HGF组c-Met的磷酸化水平明显增加，差异具有统计学意义(P＜0.05)。c-Met的特异受体抑制剂SU11274预先作用6h后，可完全阻断HGF的作用，抑制c-Met的磷酸化。HGF可抑制HG作用下MsC内ROS水平的升高，MDA水平的上升和GSH水平的下降。HG作用下大鼠MsC内过氧化氢酶(Catalase，CAT)，超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)，谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione Peroxidase，GPX)，谷胱甘肽还原酶(Glutathione Reductase，GR)的mRNA表达水平没有显著改变，但CAT，SOD和GPX的活性却明显下降，GR的活性在各组内的变化无显著差异。HGF能阻止HG作用下MsC内CAT，SOD和GPX的活性的下降。SU11274能阻断HGF上述这些作用。小结HGF对HG作用下大鼠MsC c-Met表达水平的增高没有明显影响，但却使c-Met的磷酸化水平明显增加。HGF／c-Met能显著抑制HG诱导的大鼠MsC内ROS生成的增多，恢复MsC内GSH和MDA的正常水平。HGF能抑制HG对抗氧化酶活性的损伤。第三部分HGF抑制高糖诱导的大鼠肾脏MsC内氧化应激机制的初步研究目的探讨HGF抑制HG诱导的大鼠肾脏MsC内氧化应激的机制。方法NADPH氧化酶亚基p22phox、醛糖还原酶(Aldose Reductase，AR)、谷氨酰半胱氨酸连接酶催化亚单位(Glutamate-Cysteine Ligase Catalytic Subunit，GCLC)和葡萄糖6磷酸脱氢酶(Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase，G6PD)的mRNA及蛋白表达通过RT-PCR和Western印迹法检测。EMSA和同工酶电泳法分别应用于检测上游刺激因子(Upstream Stimulatory Factor，USF)结合GCLC负调控区域的活性及G6PD的活性。结果HGF能增加HG作用下大鼠MsC内GCLC的表达，降低p22phox和AR的表达。HGF能显著抑制HG增强USF结合GCLC基因5′端负调控元件E-box元件活性的作用。HGF能增强HG作用下大鼠MsC内G6PD的mRNA和蛋白表达及其活性(P＜0.05)。SU11274可以完全阻断上述HGF的效应。小结HGF能显著降低HG所致的大鼠MsC p22phox和AR表达的增高。HGF通过降低USF结合GCLC负调控区域的活性来增强GCLC的表达，并能恢复HG引起的G6PD表达及活性的下降。结论1．Sp1介导了高糖作用下大鼠MsC c-met表达的增强的过程。2．HGF能抑制高糖诱导的大鼠MsC内的氧化应激，且该作用依赖于其受体c-Met的磷酸化。3．HGF能恢复高糖作用下大鼠MsC内ROS的生成／清除平衡，此作用与HGF可以增强大鼠MsC内GSH的合成有关。