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第一部分miR-29a促进结直肠癌远处转移的研究目的和意义远处转移是结直肠癌(CRC)患者死亡的主要原因。肿瘤远处转移是一个复杂的多步骤过程,包括原发肿瘤的生长,血管生成,癌细胞侵袭,渗入血管或淋巴管,外渗到远处的器官以及转移瘤的定居和生长。大量研究证实miRNA在CRC远处转移过程中起重要作用。本实验分析miR-29a在CRC患者临床标本中的表达及miR-29a对CRC细胞恶性表型的影响。评估miR-29a在CRC患者诊断或预后判断的应用价值。研究方法运用荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测68例CRC患者肿瘤组织中miR-29a的表达,并分析miR-29a表达水平与临床病理特征的关系。然后将miR-29a mimics和antmiR-29a分别转染CRC细胞系LoVo和HCT-116。运用transwell小室分析miR-29a对CRC细胞侵袭的影响,运用蛋白质印迹(Western blot)检测基质金属蛋白酶2和9(MMP2/9)蛋白的表达。最后,利用慢病毒技术构建miR-29a稳定转染的LoVo细胞株,建立裸鼠CRC肝转移模型,体内水平分析miR-29a对CRC远处转移的影响。研究结果qRT-PCR结果显示miR-29a表达水平与CRC肝转移正相关,而与其它临床病理特征均无显著显著相关性。细胞侵袭实验显示miR-29a mimics促进LoVo和HCT-116细胞的侵袭,而anti-miR-29a抑制LoVo和HCT-116细胞侵袭。Western blot结果显示miR-29a mimics促进MMP2和MMP9蛋白的表达,而antmiR-29a抑制MMP2和MMP9表达。裸鼠CRC肝转移模型显示miR-29a促进CRC体内远处转移。结论miR-29a表达水平与CRC远处转移正相关。miR-29a促进CRC细胞侵袭和远处转移,是CRC潜在的癌基因。第二部分miR-29a靶基因的鉴定目的确定CRC中miR-29a的靶基因,并研究miR-29a如何通过其靶基因参与CRC的远处转移。研究方法我们前期研究已筛选出CRC中miR-29a可能作用的靶点,克隆其3’UTR,构建靶基因3’UTR野生型报告基因质粒。然后将重组质粒中miR-29a的结合位点反向突变,构建靶基因3’UTR突变型报告基因质粒。运用荧光素酶实验分析miR-29a对靶基因调控作用。运用western blot技术在CRC细胞中验证miR-29a对靶基因的调控作用。运用免疫组织化学(IHC)技术检测靶基因在CRC组织及配对的非癌组织(NCT)中的表达,并运用qRT-PCR检测靶基因高低表达两组间miR-29a的表达,分析靶基因表达与miR-29a之间的相关性。最后运用transwell小室分析miR-29a所诱导的CRC细胞侵袭是否主要通过下调靶基因来实现的。研究结果根据软件预测和查阅文献,筛选出KLF4可能为miR-29a靶基因。荧光素酶实验显示miR-29a mimics和ani-miR-29a分别显著下调或上调KLF43’UTR野生型报告基因荧光素酶活性,但对KLF43’UTR突变型报告基因荧光素酶活性无明显影响。Western blot结果进一步证实miR-29a反向调控KLF4蛋白表达。IHC结果显示与配对的NCT相比,KLF4蛋白在64%(54/85)的CRC肿瘤组织中表达下调,并且KLF4蛋白表达与miR-29a表达水平呈显著负相关。细胞侵袭试验证实KLF4过表达能够阻碍miR-29a所诱导的促进侵袭作用,而KLF4siRNA能逆转antmiR-29a所导致的侵袭下调。研究结论KLF4是miR-29a的靶基因,]miR-29a可能是通过下调KLF4表达促进CRC远处转移。