猪瘟是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus,CSFV)引起的一种急性、烈性、高度接触性传染病,在我国仍时有发生,给养猪业造成重大损失。C株是世界上应用最为广泛的减毒疫苗株。大量数据表明,C株疫苗免疫效力好、安全性高,对小猪、怀孕母猪甚至是处于免疫抑制的猪群均不造成病理损伤,但是这种类型的减毒活疫苗刺激机体产生的抗体,很难和野毒感染猪产生的抗体区分开,这不利于控制猪瘟的流行与净化。为了能区分疫苗免疫动物和感染动物,DIVA疫苗是目前的研究热点。E2囊膜糖蛋白是猪瘟病毒的主要结构蛋白,是猪瘟病毒毒力及宿主范围的主要决定性因素,位于病毒粒子外表面,有跨膜区,是建立猪瘟病毒血清学检测方法的主要抗原。因此,猪瘟病毒E2蛋白是开发猪瘟病毒新型疫苗及诊断试剂的重要蛋白分子。本研究利用原核表达系统表达了猪瘟病毒的E2蛋白,利用纯化的E2蛋白制备了猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体,进一步利用制备的单克隆抗体建立了猪瘟病毒的间接免疫荧光检测方法;另外,利用纯化的E2蛋白初步研制了猪瘟E2蛋白亚单位疫苗,免疫攻毒试验结果表明,研制的亚单位疫苗免疫效果良好,为猪瘟标记亚单位疫苗的开发奠定良好基础。1猪瘟病毒E2蛋白主要抗原区的表达提取CSFV的基因组RNA,反转录为cDNA,利用oligo6设计引物扩增CSFV E2基因的主要抗原区域,连接克隆载体构建克隆质粒pMD18T-CSFV-E2’,再克隆至pET28a原核表达载体,构建E2基因的原核表达质粒pET28-CSFV-E2’。将去除跨膜域后E2基因2433bp～2672bp区间的序列进行在线密码子优化,合成优化后序列,与克隆载体pTOPO-Blunt Simple连接,将连接正确的克隆质粒命名为pTOPO-Simple-E2。利用BamH I和Sac I分别双酶切pTOPO-Simple-E2和pET28-CSFV-E2’,取目的条带连接后转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3),挑选克隆阳性菌测序,序列比对显示,优化后的部分E2基因已经替代成功,将替换后的表达质粒命名为pET28-CSFV-E2。通过IPTG诱导表达条件的优化,成功表达出E2蛋白。用Ni-NTA层析法纯化E2蛋白,经检测纯化E2蛋白的浓度可达3.48mg/ml。以商品化E2蛋白单抗进行Western blot分析显示该蛋白具有良好的抗原性。2猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的制备及IFA检测方法建立以纯化的E2蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞经PEG4000进行融合,筛选后获得两株能稳定分泌抗CSFV E2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2B1和3B4。经IFA检测,2B1和3B4的腹水效价分别为1.0×105和l.0×104,且两个单克隆抗体细胞株重链均为IgGl亚型,轻链均为k链。利用制备的单克隆抗体作为一抗,商品化的FITC-羊抗鼠作为二抗,建立了CFSV的IFA检测方法。荧光显微镜观察,102TCID50/ml的CSFV、1:100倍稀释2B1腹水单抗时,细胞出现黄绿色特异性荧光。特异性试验表明,建立的IFA检测方法只与CSFV发生特异性反应,与PCV2及BVDV不发生交叉反应。利用建立的IFA方法,检测了三批猪瘟成品疫苗的抗原含量,每批次疫苗重复检测三次。结果表明同一批次疫苗重复检测,抗原含量差异最高为100 0.1TCID50/ml,抗原含量比较稳定,验证了IFA检测方法的可重复性。利用建立的IFA检测方法和兔体热反应分别检测20批猪瘟传代细胞源活疫苗半成品疫苗的抗原含量,分析IFA与兔体效力检测结果的对应关系。结果显示,兔体定型热反应(RID)与IFA具一定对应关系。当兔体效力检测每毫升病毒培养液中含病毒10万RID时,IFA检测病毒液抗原含量在103 6TCID50/ml～l 04 25TCID50/ml之间;当每毫升病毒培养液含病毒≥50万RID以上时,IFA检测病毒液抗原含量位于104 5TCID50/m1～106 5TCID50/ml之间。因此,若要每毫升病毒培养液中抗原含量达到50万RID以上,IFA检测其病毒含量不得少于104.5TCID50/ml。因此,可以通过检测猪瘟活疫苗半成品的TCID50,为生产车间定量精准配苗提供依据。3猪瘟病毒E2蛋白亚单位疫苗的初步研制用纯化的E2蛋白(3.4mg/ml)与佐剂乳化制备了三批猪瘟E2蛋白的水包油型亚单位疫苗,物理性状检验和无菌检验均符合规定。安全检验结果表明,接种猪均表现精神状态、饮食欲正常,发育良好,未见任何全身和注射局部不良反应。随机挑取一个批次的疫苗,进行疫苗的免疫效力比较实验。活疫苗免疫组和亚单位疫苗免疫组在二免后14天,连同对照组同时用猪瘟石门系强毒攻击。结果两个免疫组猪攻毒后精神食欲状态良好,体温也没有明显波动,未出现猪瘟相关临床症状和各脏器的病理损伤,表明免疫猪可抵抗致死量猪瘟强毒的攻击。对照组猪在攻毒后第9天开始死亡,死亡猪出现典型猪瘟败血症症状。试验猪免疫后不同时间采血,ELISA检测试剂盒检测抗体效价。两种类型疫苗一免后14天抗体均转阳,一免后21天抗体继续上升;二免后抗体继续上升。其中,一免后活苗比亚单位苗免疫组猪抗体上升速度快,而二免后亚单位苗抗体上升速度较快。试验期内对照组猪抗体一直为阴性。荧光定量RT-PCR检测肺门淋巴结、腹股沟淋巴结及扁桃体中的猪瘟病毒载量。对照组猪的肺门淋巴结、腹股沟淋巴结及扁桃体中病毒含量比较多,而免疫组猪三个组织的病毒含量均较低,其中亚单位苗免疫组比活苗免疫组猪病毒含量低,表明免疫E2蛋白亚单位疫苗后,猪组织的带毒量更少,猪只更健康,可作为猪瘟净化的候选疫苗。