论文部分内容阅读
天然橡胶作为重要的工业原料和战略资源,主要来源于巴西橡胶树。橡胶树炭疽病是橡胶产量的重要影响因素之一。胶孢炭疽菌和尖孢炭疽菌都能引起橡胶树炭疽病,其中胶孢炭疽菌对橡胶树的致病力远远强于尖孢炭疽菌。前期研究中,我们分别对胶孢炭疽菌和尖孢炭疽菌进行了基因组序列测定,通过比较基因组学的方法预测并筛选出胶孢炭疽菌特有的效应蛋白基因,其中两个分别命名为CgSE1和CgSE2。本研究对CgSE1、CgSE2基因进行了克隆和分析,通过构建敲除突变体初步研究了它们的功能。具体结果如下:1.本研究通过RT-PCR技术克隆了胶孢炭疽菌特有的两个候选效应蛋白基因CgSE1和CgSE2基因,其中CgSE1基因含有一个639bp的开放阅读框,CgSE2基因含有一个435bp的开放阅读框。2.CgSE1基因编码一条含有212个氨基酸的多肽,分子量约为22.7kDa。生物信息学分析表明,CgSE1蛋白第1位-第16位氨基酸是典型的信号肽序列,含有HNHc保守结构域,属于HNH蛋白家族成员。系统进化树分析结果显示,该蛋白属于HNH蛋白家族的第二亚组。依据同源重组原理,构建了 CgSE1基因的敲除载体pCB1532-CgSE1,并通过PEG介导转化法将其转入到胶孢炭疽菌原生质体细胞中,经过氯嘧磺隆抗性筛选和分子鉴定,获得敲除CgSE1基因的敲除突变体株△CgSE1。生长特性分析表明,CgSE1基因的缺失突变使得胶孢炭疽菌的生长变慢、分生孢子产量降低,对橡胶树叶片的致病性减弱。进一步分析发现,△CgSE1菌丝的机械穿透力丧失,对氧化胁迫耐受力的降低,这些可能是导致其致病力下降的部分原因。同时,我们将CgSE1基因转入尖孢炭疽菌中,以分析其对尖孢炭疽菌的影响。以上结果表明,CgSE1基因为胶孢炭疽菌所特有,不仅参与调控胶孢炭疽菌的生长表型,同时在胶孢炭疽菌的致病性中具有重要作用。3.CgSE2基因编码一条含有144个氨基酸的多肽,分子量约为15kDa。生物信息学分析结果显示,CgSE2蛋白含有一段16个氨基酸的信号肽。同样地,为了研究CgSE2基因的功能,我们构建了CgSE 基因的胶孢炭疽菌敲除突变体株△CgSE2。研究结果表明,与胶孢炭疽菌野生型(WT)相比,ACgSE2的生长和孢子产量均受到影响,ACgSE2的致病力也显著降低。同时发现,△CgSE2菌丝的机械穿透力丧失,对氧化胁迫耐受力的降低,暗示这些可能是导致△CgSE2致病力下降的部分原因。综合以上实验结果,我们认为CgSE2基因与胶孢炭疽菌的的生长发育和对橡胶树致病性有关。