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目的:骨折不连接(non-union of fracture,NUF)也称骨折不愈合,是骨折术后常见的并发症,临床工作中发现骨折病人中,由于各种原因约有5%～10%的病人会出现骨折不连接,一旦产生骨不连其治疗仍是临床工作中面临的难题之一。九十年代初期,体外冲击波疗法(Extracorporeal Shock Wave Therapy,ESWT)成功用于骨不连的基础和临床研究,并取得积极成果,但结合干细胞移植治疗骨不连未见报道。近年来,应用骨组织工程修复骨缺损和骨不连是当今的一个热点,种子细胞是骨组织工程的重点,骨髓中的骨髓间充质干细胞(Bone marrow stem cells,BMSCs)具有自我复制、自我更新、多向分化等干细胞特性,并在一定诱导条件下可分化为成骨细胞和成软骨细胞,业已具备成为骨组织工程的理想的种子细胞的条件。本研究将ESWT结合兔自体BMSCs移植治疗兔骨不连,与ESWT或BMSCs移植治疗兔骨不连观察比较治疗的效果和差异,为临床治疗骨不连探索一种新的治疗方法,从而指导临床治疗。方法:选择新西兰大耳兔39只建立“截骨”骨不连模型。术后10周经X线证实为骨不连,采用随机对照试验的设计原则分为四组A、B、C、D。A组每只动物骨不连行ESWT+BMSCs干预; B组BMSCs移植; C组行ESWT; D组不做任何治疗。无菌条件下从股骨远段内侧穿刺抽取A、B组自体兔骨髓间充质干细胞进行培养。四个组纳入实验流程,A组、C组动物骨不连断端采用进行体外冲击波治疗;随后A组和B组行自体BMSCs移植治疗骨不连;对照组不做任何处理。各组兔子在治疗前和治疗后2周、6周、10周重复x线检查,所得X线片子,扫描后在计算机上精确测量治疗前后骨折间隙的平均宽度,计算骨缺损区骨痂的生成量。摄片后处死动物,处死前15 d和前7 d连续肌内注射四环素3 d。取骨折间隙组织HE染色观察成骨细胞、骨小梁的数量和排列的形成。免疫组化方法观察溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine,BrdU)标记情况,测定标本中的血管内皮生长因子(Vascular endothelial cell growth factor,VEGF)含量。不脱钙切片荧光显微镜下观察新骨形成情况计算骨矿化率(bone mineralization apposition rate, MAR)。对所有数据x±s表示统计学分析,设定P<0.05为有统计学意义。结果:1骨髓间充质干细胞的形态观察:分离获取了高纯度的BMSCs,保持了细胞的活性。Percoll分离液( l .073g/ml)分离的骨髓单个核细胞24小时后贴壁,细胞呈圆形,48～72小时后呈纺锤形,梭形,增殖迅速,原代培养约10～14天左右可以达到80～90%融合,传代细胞24小时完全贴壁,5～7天达到80～90%融合,传代后的细胞形态与原代细胞相似, 4～5天后,细胞汇合,细胞外形更趋于一致,呈平行排列。2细胞表面分子测定:已分离纯化后的细胞经流式细胞仪检测,细胞表面抗原CD44的表达阳性率91.23%,而CD34的表达阳性率1.35%,符合兔BMSCs的细胞表面特征。3 BrdU标记:经BrdU标记的MSCs48h后标记率>98%,并在6周时相点发现,移植的自体骨髓间充质干细胞成功参与了骨折的修复,BrdU对骨髓来源间充质干细胞起到较好的标记和“跟踪”作用。标本行免疫组织化学染色,可见成骨细胞及骨细胞的核均呈棕褐色,证实所移植的骨髓基质干细胞参与了新生骨的形成。4HE染色观察:治疗后2、6周各干预组成骨细胞和间充质细胞聚集增生活跃,骨小梁形成丰富, A组优于其他各组,10周时A、C组表现骨性愈合。而对照组一直表现为慢性炎症反应,纤维结缔组织增生,骨小梁形成少。5 X线摄片观察结果:骨不连模型形成时,间隙平均变化为:5.78±0.98(mm)。治疗后2周时,A、B、C、D各组骨不连间隙变化分别为6.83±0.65,6.14±0.45,6.61±0.68,5.79±0.68。A组与B、D组比较均有统计学意义(P<0.05),其中与D组P<0.01,C组为与B组比较有统计学意义(P<0.05);6周时,对照组与各实验组比较有统计学意义(P<0.01),A组间隙变化为8.14±0.45与B、C组比较有统计学意义(P<0.05);10周时,A组已达骨性愈合,骨不连间隙变化最大为9.86±0.26;B组为7.67±0.30,与A、C组(9.13±0.43)比较有统计学意义,A组优于C组。对照组与各实验组比较有统计学意义(P<0.01),各实验组与治疗前比较均有统计学意义。各组各时相点骨痂生成量的多少的比较与骨不连间隙变化相吻合。6 VEGF测定:在干预后的2周、6周时相点,干预组的VEGF阳性表达都强于对照组13.45±3.21(P<0.01),A组VEGF阳性数分别为52.18±5.63,48.27±3.35均好于B、C组(P<0.05);10周时,A、C组稳定表达VEGF,分别为:49.40±4.53,38.69±4.61,B组表达下降,但都好于对照组15.40±4.61(P<0.01),C组好于B组(P<0.05)。7四环素荧光标记情况:在干预后的2周、6周时相点,干预组都有明显的荧光标记迹象,发出明亮金黄色荧光,标记线较宽,可见清楚的骨小梁板层结构,A组、C组持续稍弱荧光在10周,A组好于C组。B组10周时则较6周时明显减弱,对照组在各时相点无荧光标记。各实验组MAR在2周时最大,分别为:4.53±0.12,3.11±0.08,3.64±0.17(um/d),显示结果与VEGF免疫组织化学染色相吻合。结论:ESWT结合自体BMSCs移植治疗骨不连缩短了治疗时间,提高了骨缺损处VEGF的表达和骨痂量的生成,更好的促进了骨折的愈合,优于ESWT治疗和自体BMSCs移植治疗。