曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)是我国沿海海域最重要的海洋头足类物种,现人工养殖已经取得突破。但养殖过程中普遍出现的性早熟现象严重影响其养殖效果,因此揭示养殖条件下的乌贼生殖发育调控机制是解决这一问题的关键。雌激素受体(estrogen receptor,ER)是典型的性类固醇核受体,在许多海洋动物的性成熟和生殖发育中扮演着重要角色。鉴于ER可能也参与乌贼的生殖发育调控,本文首次开展了曼氏无针乌贼雌激素受体sjER基因克隆和序列特征分析、亚细胞定位和受体类型鉴定、可能作用位点及组织分布特征、在生殖周期中变动规律及在生殖发育中的调控功能等方面的研究。主要取得的研究结果如下:采用Illumina Hiseq 2000高通量测序技术构建了曼氏无针乌贼未成熟和成熟卵巢转录表达谱数据库,经去冗余处理和拼接处理后,共计获得70,039条Unigenes,均长800 bp,40.7%(28,492)Unigene获得注释信息,其中近38.5%(10,969)Unigene获得GO分类注释。筛选获得了一批性腺发育相关基因序列,未成熟卵巢转录组中有793条高丰富表达(FPKM≥100)基因,成熟卵巢转录组中找到38条高丰富表达基因。成熟与未成熟阶段卵巢转录组相比,基因表达显著下调(P<0.001)基因为46,071个,显著上调基因为1,217个,其中ER在卵巢成熟阶段基因表达量显著上调,注释的ER基因序列与章鱼的ER基因序列同源性高达80%以上。采用5’和3’RACE技术获得了sjER的全长序列,并对其序列特征进行了分析,结果表明,sjER cDNA序列(KT278504)全长1,788 bp,包含280 bp的5’UTR,38 bp的3’UTR和1,470 bp的ORF,可编码489个氨基酸。与其他核受体结构一样,sjER可分为:A/B区(N端,130aa),C区(DNA结合区DBD,80aa),D区(铰链区,35aa)、E区(配体结合区LBD,228aa)和F区(C端,16aa)。C区和E区高度保守,和真蛸ER相似性高达100%和96%。ER系统进化分析发现,动物中雌激素受体明显分为三支:脊椎动物雌激素受体(ERα、ERβ和ERγ),头索动物雌激素受体和无脊椎动物雌激素受体。sjER和软体动物聚为一支,与头足类真蛸ER同源性高达89%。对sjER受体性质及定位进行分析,结果表明,通过构建sjER-EGFP表达载体,转染至HEK293细胞中,用荧光染料DiI染膜、DAPI染核,在激光共聚焦显微镜下观察发现绿色荧光主要定位在核上,确定sjER定位于细胞核上,与sjER序列中存在两个核定位信号NLS的预测结果相一致,表明sjER是一个核受体,可能通过配体依赖激活特定基因转录行使功能。对sjER表达的组织特异性及其随性腺发育的波动规律进行研究,结果表明,荧光定量PCR方法检测出sj ER基因在曼氏无针乌贼雌性和雄性不同组织器官中广泛表达,在脑、性腺和肝等生殖发育相关组织中有较高的表达量,在其他组织中表达量相对较低。sjER的表达在乌贼的生殖发育周期中有明显的波动,在卵子发生的卵原细胞阶段,原生质生长阶段和间质生长阶段,sjER表达量随卵子发生的推进而显著上升(P<0.05),到发育成熟阶段即营养质生长阶段sjER表达量则显著下降。乌贼生殖发育中sjER表达量变化与我们测定的卵巢中E2含量的变化趋势一致,说明ER在头足类性腺发育和成熟过程中可能扮演着重要角色。为探讨sjER究竟如何行使乌贼生殖发育的调控功能,我们将ERE-pGL3和sjER-Flag共转染到HEK293细胞中,研究雌激素和sjER是否通过雌激素反应原件ERE的激活来行使核受体功能。结果表明,sjER-Flag的转染能显著促进ERE表达量的成倍增加(P<0.05),该促进作用可被ER的特异性抑制剂Tamoxifen显著抑制(P<0.05),说明sjER对乌贼生殖发育的调控可能是通过sjER促进相关靶基因的ERE转录这一经典核受体途径来实现的。但添加17β-雌二醇(E2)并不能显著提高sjER对ERE的激活作用(P>0.05),可能说明sjER的转录激活作用不依赖于sjER与配体E2的结合,而是依赖类似于其它软体动物ERs那样的自激活作用。在Ca2+流和cAMP测定实验中,E2的添加未能诱导sjER-Flag转染的HEK293细胞胞内出现cAMP和Ca2+第二信使,表明sjER可能并不能像许多高等动物ER那样通过与膜受体的相互作用介导膜信号转导途径。本论文的研究结果对于今后进一步阐明曼氏无针乌贼等头足类的生殖发育调控机制,掌握类固醇激素对头足类及软体动物性成熟的影响奠定基础。同时,也为揭示曼氏无针乌贼等海洋头足类人工养殖下的性早熟原理提供一定的理论基础。