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大黄鱼(Larimichthys crocea),隶属鲈形目、石首鱼科(Sciaenidae),曾广泛分布于中国东海、南海以及黄海南部,是我国特有的地方性鱼类。大黄鱼现已发展成为我国海水网箱养殖量最大的鱼种,具有很高的经济效益。近年来,由弧菌属细菌引起的弧菌病呈爆发趋势。该病传播速度快、死亡率高,对大黄鱼养殖业造成了严重冲击。补体是鱼类免疫系统最重要的组成部分,具有识别和消除外来病原体,激活免疫细胞,调控获得性免疫等功能。在免疫组织中,补体调节因子大约占据了补体成分的二分之一,当受到外界病原刺激时会迅速活化为补体成分,并且进一步聚合形成酶复合物发挥一系列免疫效应。本文以大黄鱼为对象研究补体调节因子CFH、CFHR1、CFHR2在大黄鱼组织中的表达特异性,并通过溶藻弧菌侵染大黄鱼实验研究补体调节基因的急相反应,对基因序列进行了生物信息学和系统进化分析,并对功能进行初步探索。一、从大黄鱼基因数据库中获得三种补体调节因子cDNA序列:L.c-cfh cDNA全长1332bp,编码443个氨基酸,多肽相对分子质量为49.96KDa,等电点为6.66,GenBank登录号为KP710858;L.c-cfhr1 cDNA全长411bp,编码137个氨基酸,多肽相对分子质量为15.69KDa,等电点为4.75,GenBank登录号为KP710860;L.c-cfhr2 cDNA全长1170bp,编码389个氨基酸,多肽相对分子质量为43.53KDa,等电点为5.61,GenBank登录号为KP710859。二、氨基酸序列结构分析表明补体调节因子具有RCA蛋白家族的典型特征。L.c-cfh含有5个保守的CCP结构(补体控制蛋白),序列存在1个N-糖基化位点(Asn237);L.c-cfhr1含有1个CCP结构,没有发现糖基化位点。L.c-cfhr2含有4个CCP结构,序列存在3个潜在的N-糖基化位点(Asn90,Asn112 and Asn 148)。三、实时荧光定量PCR结果显示,L.c-cfh在肝、脾、肾、肠、脑、鳃、心、和肌肉这8种组织中都有表达,其中肝脏的表达量显著大于其它几种组织。表达量高低依次为:肝、肠、心脏、肾、脾、肌肉、脑、鳃。溶藻弧菌感染后,L.c-cfh在肝脏中表达量小幅升高,24h达到峰值,此后表达量虽然有所回落,但仍远高于对照组。在脾脏中L.c-cfh表达量从12小时开始迅速上升并且在24小时达到峰值(p<0.05)。24小时之后逐渐恢复到12小时之前的水平,但仍然略高于对照组的表达量。在肾脏中L.c-cfh表达量在0到36小时变化不大,直到48小时开始迅速上升并且达到最高值(p<0.05)。四、L.c-cfhr1的表达量高低依次为:肝、心脏、脾、肾、鳃、肠、肌肉、脑。溶藻弧菌感染后,0到12小时,L.c-cfhr1在肝脏中的表达量升高不明显(P>0.05),12到24小时表达量有了一个显著增长(P<0.05),并且到达峰值。24小时之后,表达量略有下降但和对照组相比依然显著。脾脏在被侵染6小时以后,表达量呈现温和上升趋势。在感染后36小时L.c-cfhr1表达量为对照组的2.5倍(P>0.05),到了48小时L.c-cfhr1的表达量达到峰值为对照组的6.5倍(P<0.05)。肾脏中的表达量在0到24小时虽有所波动但变化不是很大,24小时之后迅速升高为对照组的6.2倍,之后有所回落但仍然显著高于对照组。五、L.c-cfhr2的组织表达量高低依次为:肝、肾、肠、鳃、肌肉、心、脾、脑。溶藻弧菌感染后的0到12小时,L.c-cfhr2在肝脏中的表达量温和上升(P>0.05),12到24小时L.c-cfhr2 mRNA表达量有了一个显著增长(P<0.05),并且到达最高点。24小时之后,表达量略有下降但依然维持比较高的水平。L.c-cfhr2表达量在脾脏中呈现温和增长趋势,在感染后6小时L.c-cfhr2表达量为对照组的1.3倍(P>0.05),到了12小时基因表达量出现了降低,而24小时之后表达量增为对照组的2倍左右,并一直维持到48小时。L.c-cfhr2在肾脏中的表达量在0到36小时有一个缓慢增长,在36小时的表达量为对照组的1.7倍(P>0.05)。36小时之后,表达量有了显著上升,达到峰值为对照组的7.4倍(P<0.05)。六、系统进化树分析表明,鱼类与哺乳类补体调节因子基因都分别形成各自的支系,然后再聚成一大类,符合传统分类法。本论文证实了大黄鱼补体调节蛋白的存在,表明鱼类具有一套较为完整的补体调节系统,为大黄鱼的免疫调节机制的最终阐释提供资料支撑,也为研究CFH基因家族在先天免疫中的功能及其进化提供了基础。