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玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN,ZEA)是一种具有二羟基苯甲酸内酯结构的真菌毒素,由镰刀属(Fusarium)真菌产生,主要存在于霉变的玉米、小麦等谷类作物中,具有生殖毒性、内分泌毒性和肝脏毒性,对家禽家畜危害明显,并威胁着人类的健康。相比物理和化学去除ZEN毒素的方法,生物法脱毒效率高、特异性强,对食物的营养成分破坏少,反应产物无毒,对环境无污染,是目前生物毒素研究的热点。本实验室从土壤中分离出一株不动杆菌Acinetobacter sp.SM04可将ZEN降解成极低雌激素毒性的产物,从其培养上清液中分离出一种过氧化物酶组分,并将其基因克隆表达到毕赤酵母宿主内,优化培养后可大量分泌表达该重组过氧化物酶A4-Prx。本论文致力于从该重组毕赤酵母的培养上清液中分离纯化得到过氧化物酶A4-Prx,研究其酶学特性,初步探索ZEN毒素被A4-Prx降解后的结构变化。本论文通过诱导培养重组毕赤酵母工程菌GS115/p PIC9K-A4-Prx,从其培养上清液中采用一系列蛋白分离纯化手段得到重组过氧化物酶A4-Prx,研究结果表明先用60%硫酸铵沉淀,再用0.02M Tris-HCl(p H8.0)进行凝胶过滤Sephadex G-100柱洗脱,然后进行离子交换Sephadex DEAE-52柱的梯度盐洗脱,三个步骤结合得到高纯度且具有生物活性的过氧化物酶A4-Prx,分子量为41 k Da。监测纯化过程中的过氧化物酶酶活变化,得出最终纯化倍数为12倍,纯化效果良好。本论文对过氧化物酶A4-Prx进行了酶学特性研究,结果显示:反映体系中的p H和反应温度均对过氧化物酶A4-Prx的酶活有着显著影响,p H为9.0和温度为60℃时A4-Prx的过氧化物酶酶活最高;当H2O2浓度低于20 mmol/L时,A4-Prx的过氧化物酶酶活随着H2O2浓度的升高而升高,反应符合米氏方程一级反应动力学,但当H2O2浓度高于50 mmol/L时,A4-Prx的过氧化物酶酶活开始下降,最大酶活反应速率Vmax等于204.1U,此时Km值为4.85 mmol/L;苯酚和4-氨基安替吡啉两种底物的浓度升高时,过氧化氢的Km值降低,但Vmax基本不变;两种抑制剂中,EDTA对过氧化物酶A4-Prx的酶活抑制作用显著,EDTA浓度为10 mmol/L时,过氧化物酶A4-Prx的酶活迅速下降80%,叠氮钠对过氧化物酶A4-Prx的酶活的抑制作用不显著,叠氮钠浓度为60 mmol/L时,酶活抑制率不足40%;过氧化物酶A4-Prx属于硫氧还蛋白依赖的过氧化物酶,其中不含有血红素,不属于血红素依赖型过氧化物酶。本论文利用HPLC法测得过氧化物酶A4-Prx具有ZEN降解能力,且降解率达到63%。因此,对过氧化物酶A4-Prx降解ZEN的产物进行了初步分析实验。对过氧化物酶A4-Prx乙与ZEN的反应液进行了乙酸乙酯萃取,再利用薄层层析法分离,得到两种反应产物,测定产物的红外吸收光谱,分析得出过氧化物酶A4-Prx催化ZEN与过氧化氢反应过程中,ZEN中的酯键发生了断裂,生成羧基COOH,且酚羟基O-H被还原成-O-,暴露出来的活性位点与体系中的其他游离离子结合。