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呼吸道合胞病毒是婴幼儿急性下呼吸道感染最主要的病毒病原体之一，流行病和免疫学研究显示，RSV感染引起的毛细支气管炎和哮喘间有着密切的关系。目前，RSV 感染发病机制尚未完全清楚，亦缺乏有效的治疗手段和疫苗防治RSV感染。脱氧核酶是继核酶之后又一崭新的分子生物学工具，能够将RNA分子在未配对的嘌呤和配对的嘧啶间切断，从而调控基因的表达。本研究初步探讨了RSV感染气道上皮细胞后粘附分子-1及核因子-КB的变化，同时，针对RSVM2-2mRNA 设计合成10-23脱氧核酶，观察其在体外细胞培养系统抗RSV效应，为防治RSV感染寻求新的方法。第一部分 呼吸道合胞病毒感染气道上皮细胞后ICAM-1及NF-κB的变化背景与目的： 细胞间粘附分子-1（ICAM-1）是近年来发现的一种重要生物活性物质，对局部炎症的发生和形成具有重要作用，是目前唯一明确的中性粒细胞与上皮细胞间相互连接的配体，可在多种细胞如成纤维细胞、内皮细胞以及上皮细胞内表达。气道上皮细胞既是炎症的靶细胞，又扮演着效应细胞的角色，可分泌和表达多种细胞因子及粘附分子，从而参与炎症反应的全过程。呼吸道合胞病毒是导致婴幼儿毛细支气管炎和肺炎住院的主要的病原体之一，尽管已有研究证实RSV感染后能够上调气道上皮细胞ICAM-1表达，但RSV作用的时间依赖模式以及其作用机制目前尚未完全清楚。核因子-κB是一种转录因子，经体外实验及基因结构分析表明，编码支气管上皮细胞的多种炎性因子基因都包含NF-κB的结合位点，因此推测RSV感染气道上皮细胞后ICAM-1的表达与核转录因子NF-κB的活化有关，本研究目的旨在通过体外建立RSV感染人气道上皮细胞模型，检测RSV感染后不同时间点粘附分子-1（ICAM-1） 的表达变化以及核转录因子NF-κB活性改变，初步探讨气道炎症的发生机制及其防治措施。<WP=7>方法：以不同感染量（moi）的RSV感染气道上皮细胞（9HTE cell），观察细胞病变效应。以感染复数moi=0.1的RSV感染气道上皮细胞，用免疫组织化学染色方法检测感染RSV48h后ICAM-1蛋白的表达情况。用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测上皮细胞感染RSV后0.5h,1h,2h,3h ICAM-1 mRNA 丰度的改变。采用凝胶电泳迁移率（EMSA,Electrophoresic mobility shift assay）方法检测9HTE细胞感染RSV后不同时间点核转录因子NF-ΚB活性的变化。结果：在体外成功建立RSV感染气道上皮细胞模型，当感染量为0.001moi时，大部分9HTE细胞能够存活，而病毒感染量在0.1moi以上时，培养5d后细胞几乎全部死亡。免疫组织化学染色结果表明，正常人气道上皮细胞（9HTE）表达ICAM -1较弱，阳性率仅为1+～2+，而在RSV感染后48小时，9HTE 细胞表达ICAM-1明显增加，阳性率可达3+～4+。RSV感染能够上调ICMA-1mRNA 的表达，且具有时间依赖关系，在本实验中，RSV感染后2h-3h ICAM-1mRNA达到峰值（p<0.05）。EMSA检测结果发现随着感染时间的逐渐延长，核因子NF-ΚB的活性也逐渐增强，当感染RSV90min时，NF-κB的活性最强，而未感染RSV的上皮细胞NF-κB表现出较低的结合活性。结论：本研究表明RSV感染可明显上调气道上皮细胞ICAM-1的表达，且呈现时间依赖关系，提示ICAM-1在气道局部炎症中起重要作用。RSV感染可激活核转录因子NF-κB，而NF-κB的活化是启动RSV感染后气道上皮细胞合成炎性蛋白、触发炎症反应的中心环节，提示应用IL-10、抗氧化剂等NF-κB抑制物可为控制病毒感染引起的炎症反应提供新途径。第二部分：抗RSV10-23型脱氧核酶的体外筛选、修饰及细胞毒性研究背景与目的：由四种碱基构成的RNA分子化学结构与蛋白质比较相对简单，其生物学功能主要是作为翻译蛋白质及多种病毒遗传物质的载体。因此，选用RNA作为生物基因治疗的目标分子有着明显的优势。反义寡聚核酸技术是最早在RNA水平进行基因抑制的方法，通过碱基互补与RNA分子结合形成异二聚体，直接阻断翻译过程或激活胞内酶RNaseH, 降解RNA分子。 具有发夹或锤头型结构的核酶也具有降解RNA的功能，因为核酶分子中包含切割RNA的结构，不需要激活胞内酶就能降解靶RNA分子，与反义寡聚核糖核酸（AODN） 比较具有更多的优势。脱氧核酶是<WP=8>利用体外分子选择技术筛选的具有催化功能的DNA片段，由催化核心和底物识别臂两部分组成，兼顾了反义核酸和核酶的的双重优势，能够在未配对的嘌呤和配对的嘧啶碱基间将靶RNA分子切断，在基因治疗领域显示出潜在的应用价值。本研究针对RSVM2-2mRNA靶位点设计10-23型脱氧核酶，通过体外转录技术在体外筛选切割M2-2mRNA的DNAzyme，同时对10-23脱氧核酶进行化学修饰以提高DZ膜透性，并对其细胞毒性进行评价。方法：针对RSVM2-2mRNA 不同位点设计合成3种10-23型脱氧核酶：DZ8269、DZ8277和RSV2UDZ，通过体外转录技术生成底物RNA，在体外无细胞系统进行切割、筛选；在脱氧核酶的5’端和3’端以共价键连接胆固醇分子，通过流式细胞仪检测DZ在K562细胞的摄入效率；用MTT方法评价DZ对9HTE细胞的毒性作用。结果：10-23DZ8269和10-23DZ8277 具有切割RSV M2-2 mRNA 的活性，其中10-23DZ8269的切割效率最高；而RSV2UDZ及抗RSV基因组的DZ604、DZ595不能?