第一部分ETV6/RUNX1阳性儿童急性B系淋巴细胞白血病临床预后研究目的ETV6/RUNX1融合基因是儿童B系急性淋巴细胞白血病(B-ALL)中最常见的染色体易位,本研究拟探讨和验证该融合基因在中国汉族儿童B-ALL中的阳性率及其对预后的影响。方法将自2007年1月1日至2014年12月31日在上海儿童医学中心确诊,并经序贯治疗的B-ALL患儿予以入组研究。所有患儿均通过FISH和RT-PCR技术检测ETV6/RUNX1融合基因,最后综合临床信息资料进行分类统计分析。结果共有723名B-ALL患儿入组本次研究。其中,ETV6/RUNX1阳性B-ALL患儿有151名,阳性率为20.89%(151/723)。在723名B-ALL患儿中,共有91名患儿复发,其中,ETV6/RUNX1阳性患儿复发的有10名,占复发患儿的10.99%(10/91),明显低于其在B-ALL中的总体阳性率20.89%(151/723)(P=0.0126),表明ETV6/RUNX1融合基因确与预后良好相关。同时,在ETV6/RUNX1阳性患儿中,除1名患儿是在诊断后65天复发外,其余9名患儿的复发时间均超过300天,最长的为1662天,平均907.3天(SD±524.1),而ETV6/RUNX1阴性患儿的复发时间,最短45天,最长为1996天,平均为634.01天(SD±470.17),尽管两组患儿的复发时间经统计无显著统计学差异(P=0.09),但是,在对复发时间的分布区域进行分析后发现,ETV6/RUNX1阳性患儿的复发期主要集中于临床化疗结束后,而阴性患儿的复发区域主要集中于维持治疗期,两者的复发时间段分布存在显著的统计学差异(P<0.0001)。结论ETV6/RUNX1融合基因在中国汉族儿童B-ALL中的阳性率为20.89%(151/723),略低于欧美国家,但同样也是一个预示预后相对良好的生物学标志。第二部分ETV6基因对ETV6/RUNX1融合基因阳性白血病细胞的生长调控机制研究目的由t(12;21)(p13;q22)形成的ETV6/RUNX1融合基因是儿童B系急性淋巴细胞白血病(B-ALL)中最常见的染色体易位异常,且预后较好,却易于发生晚期复发。本研究拟探讨ETV6基因对该融合基因阳性白血病细胞的生长调控机制。方法构建ETV6慢病毒过表达载体和ETV6慢病毒干扰载体(Sh RNA)分别用于转染人白血病细胞株REH,以观察转染前后REH细胞的生长曲线和细胞凋亡率,以及ETV6/RUN-X1融合蛋白表达水平的变化差异。结果在对ETV6基因分别实施过表达和Sh RNA干扰后,REH细胞的生长速率均呈现下降趋势,而且Sh RNA干扰后的细胞生长速率下降更为显著。尽管,ETV6过表达后的REH细胞生长速率的下降幅度低于ETV6基因被干扰后,然而,ETV6过表达后的REH细胞凋亡率却增幅显著,由过表达前的1.5%增加到过表达后的5.7%,明显高于ETV6基因被干扰后的细胞凋亡率的增加幅度(由1.1%增高到1.9%);当ETV6基因过表达时,ETV6/RUNX1融合蛋白的表达水平基本没有显著差异。但是,在ETV6基因被干扰后,不仅ETV6基因的表达显著下降(P<0.0001),而且ETV6/RUNX1融合蛋白的表达水平也明显下降(P<0.001),这可能是由于针对ETV6基因设计的慢病毒干扰载体,也可能同时对ETV6/RUNX1融合基因中的ETV6部分也有一定的干扰作用,从而影响了整个融合基因的表达。结论ETV6基因可通过促进细胞凋亡以发挥其抗白血病的作用,而ETV6/RUNX1融合蛋白对于白血病细胞的作用应是促进细胞的生长和增殖,而非抑制其凋亡。第三部分GNAO1基因突变对ETV6/RUNX1阳性儿童急性B系淋巴细胞白血病发病的影响研究第一节基于同卵孪生子共患ETV6/RUNX1阳性急性B系淋巴细胞白血病的全外显子测序筛选“二次打击”的突变基因研究目的对ETV6/RUNX1阳性的同卵孪生子B-ALL患儿进行全外显子组测序,并对发病前后的测序结果进行比对分析,以期筛选出与ETV6/RUNX1阳性儿童B-ALL发病有关的基因异常,即可能的“二次打击”具体事件。方法先将抽提的同卵孪生子患儿A和B的骨髓DNA样本予以片段化,随后采用人基因组基因表达序列探针-Sure Select XT Human All Exon 50M kit对待检测样本的全外显子序列进行捕获,之后运用第二代高通量测序平台-Hi Seq2000(Illumina公司)对捕获的外显子序列进行测序,获得相当于人类基因组全外显子区域120倍覆盖度的序列,并将获得序列定位于相应的人类基因组序列。最后,经SAMtools、GATK等工具软件进行生物信息学统计分析,参考人类基因组数据库公布的序列信息(hg19),经比对后找出各自不同于参考序列的单核苷酸变异,如SNV、CNV和In Del等改变,并在基因组中定位以确定其所影响的蛋白编码或调控信息。同时,通过比对患儿A发病期和缓解期,以及患儿B发病前后的基因序列变化以筛选出可能与ETV6/RUNX1阳性B-ALL发病相关的异常基因突变。结果在患儿A和患儿B中,两者共有的突变基因仅有GNAO1-R209C符合致病基因的特征,且均为杂合子突变。其中,患儿A发病样本测序所获的GNAO1基因突变的reads ratio是50%(测序深度50,突变型测序深度25,25/50,50%),其时骨髓样本中ETV6/RUNX1阳性的白血病细胞比例为95%;而在患儿B,发病时测序所获的GNAO1基因突变的reads ratio是46.43%(测序深度56,突变型测序深度26,26/56,46.43%)。尤为重要的是,患儿B发病前2个月,其骨髓样本测得的GNAO1-R209C位点突变的reads ratio仅为0.35%,但在2个月后发病时,该reads ratio已达46.43%,而此时患儿的ETV6/RUNX1阳性细胞比例也由发病前的12.5%上升至96.2%。鉴于发病时患儿骨髓样本中的ETV6/RUNX1阳性白血病细胞占据95%以上,故可确认GNAO1基因突变发生于白血病细胞内。结论在这对共患ETV6/RUNX1阳性儿童B-ALL的同卵孪生子患儿中,GNAO1-R209C位点的突变与其白血病的发生应有着一定的内在联系,并应是导致其白血病最终发生的“二次打击”事件。第二节ETV6基因对GNAO1基因的表达调控目的明确ETV6基因和GNAO1基因两者间是否存在相互的调控作用,从而有助于探讨GNAO1基因作为“二次打击”事件的可能性,以及可能的打击机制。方法构建ETV6慢病毒过表达载体和ETV6慢病毒干扰载体(Sh RNA)分别用于转染人白血病细胞株REH,以观察转染前后GNAO1基因的表达差异。结果ETV6基因过表达后相对于对照组,GNAO1基因的表达水平明显下调;而针对ETV6基因实施的Sh RNA干扰后,GNAO1基因的表达却呈现上调。结论ETV6基因对GNAO1基因的转录表达有直接的调控作用;同时GNAO1基因可能对ETV6基因的抑癌作用存在补偿和协同机制。