近年来,PRKAR1A被越来越多的研究者所关注,因为其失活性突变可以导致以心脏粘液瘤和内分泌系统多发肿瘤为主要临床表现的Carney综合征的发生,所以被广泛认为是一个抑癌基因。动物实验已经证明,PRKAR1A的突变可以导致多种内分泌系统恶性肿瘤的发生。同时越来越多的证据表明,虽然PRKAR1A在非家族性内分泌系统肿瘤的患者中基因突变的发生率并不高,但其在转录和翻译水平发生的表达水平下调也在肿瘤的发生和发展中也起到一定作用,目前具体机制尚未明确。PRKAR1A的表达下降会导致PKA活性的异常升高,从而激活PKA通路,因此我们认为PRKAR1A-PKA通路的变化有可能在肿瘤的发生和发展中起到一定作用。为验证PRKAR1A-PKA通路在心脏粘液瘤和内分泌系统肿瘤的发生和发展过程中的作用,我们分别在个体水平(家族性心脏粘液瘤)、整体水平(19例心脏粘液瘤分析)和细胞水平(乳腺癌细胞系)进行分析,并对其致病机制做初步探讨。目的:分析、并证明PRKAR1A-PKA在肿瘤发生过程中的作用,并探讨其机制。方法:(1)由PRKAR1A剪切位点突变导致Carney综合征家系的临床及基础研究1)通过对家系成员临床资料和遗传学资料的研究,了解疾病在家系中的发病频率和遗传学特点。2)通过外显在捕获测序技术对先证者血样标本进行测序,并对所得结果进行分析,通过对SNPs和In Dels位点的分析,确定疾病的责任基因,并分析其可能对PRKAR1A转录翻译的影响。3)抽取全部家系成员外周血,根据上一步实验找到的可疑位点上下游设计引物,进行一代测序,并将测序结果与家系遗传学特点相比较,验证可疑突变位点是否导致疾病。4)应用逆转录PCR技术在m RNA水平分析突变位点对PRKAR1A转录的影响。5)在先证者肿瘤组织中检测PRKAR1A表达情况,分析突变位点对翻译的影响。(2)PRKAR1A在心脏粘液瘤中的作用及机制研究1)共收集19例非家族性非Carney综合征的心脏粘液瘤患者的粘液瘤标本。2)对19例粘液瘤样本中PRKAR1A的m RNA水平进行半定量检测,分析PRKAR1A在非家族性非Carney综合征的心脏粘液瘤患者肿瘤中的转录情况。3)应用Western blot方法检测在心脏粘液瘤中PRKAR1A蛋白的表达水平,同时应用PRKAR1A的C端抗体和N端抗体,初步判断是否存在结构异常。4)应用Western blot方法检测CREB和ATF2蛋白的表达水平,并通过其磷酸化程度的变化评估其与PRKAR1A-PKA之间的联系。5)对7例心脏粘液瘤患者粘液瘤的PRKAR1A基因进行目的外显子捕获测序,并对突变位点应用一代测序在肿瘤组织和外周血中进行验证。(3)PRKAR1A-PKA通路在乳腺癌中的作用及机制研究1)应用Western blot方法检测6组乳腺癌样本中PRKAR1A表达情况。2)验证依托泊苷在体外对人乳腺癌细胞系的杀伤作用,并通过MTT确定依托泊苷的工作浓度和工作时间。3)应用Westurn blot方法检测CREB磷酸化程度,确定PKA抑制剂H89和PKA激活剂Forskolin的工作浓度和工作时间。4)通过检测不同时间点CREB和ATF2的磷酸化程度,明确PKA激活剂Forskolin对CREB和ATF2活化程度的影响。5)分别加入H89、Forskolin、Forskolin+PKC抑制剂,明晰PKA、PKC通路对人乳腺癌细胞对依托泊苷敏感性的影响。6)提取细胞核蛋白,检测H89、Forskolin、Forskolin+PKC抑制剂对CREB和ATF2活化入核的影响。7)揭示H89、Forskolin、Forskolin+PKC抑制剂对BCL2表达水平的影响。结果:(1)由PRKAR1A剪切位点突变导致的Carney综合征家系的临床及基础研究1)家系图和临床症状表明,整个家系中先证者和母亲可被确诊为Carney综合征。2)通过外显子捕获测序,我们共确定了130个SNPs位点和3个插入/删除突变位点。其中3个In Del位点均可引起移码突变,包括NF1的第55外显子(c.8075dup G),PRKAR1A第六外显子(c.549+1del G)和RECQL1第15内含子(c.2297-1del G)。根据文献报道,我们认为PRKAR1A第六外显子(c.549+1del G)是本家系的致病基因。3)一代测序结果表明,先证者和母亲发生突变,突变形式完全一样,而父亲和哥哥的测序样本中均未发现突变。突变结果与临床表现完全符合。4)逆转录PCR结果显示,母亲和先证者的样本中发现了包含未剪切的第六内含子的m RNA。对PCR产物的碱基序列进行分析后证明,该家系中的PRKAR1A突变可以在翻译时在185号缬氨酸后发生移码突变,在继续编码9个新的氨基酸后提前出现终止子TGA。5)Western blot结果显示,先证者的粘液瘤组织中PRKAR1A分子量正常,但在粘液瘤组织中PRKAR1A的表达量与对照组(正常心肌组织)相比明显下降(P<0.05)。说明变异的m RNA未被翻译。产生疾病的原理是无意义m RNA降解作用导致的PRKAR1A表达下降。(2)PRKAR1A在心脏粘液瘤中的作用及机制研究1)PRKAR1A的m RNA水平在心脏粘液瘤中明显降低。2)PRKAR1A蛋白在心脏粘液瘤中含量明显减少(包括C端和N端抗体结果)。3)p CREB/CREB和p ATF2/ATF2在肿瘤组织中表达均明显升高。4)CREB磷酸化水平的升高与PRKAR1A的表达下调呈弱相关,但没有统计学意义。5)超过21%的非家族性心脏粘液瘤存在PRKAR1A失活性突变率,超过54%的非家族性心脏粘液瘤PRKAR1A表达下降与PRKAR1A失活性突变有关,并且这种突变是肿瘤组织特有的,在外周血中并未发现,可能是心脏粘液瘤发生的主要原因。(3)PRKAR1A-PKA通路在乳腺癌中的作用及机制研究1)乳腺癌组织中的PRKAR1A突变率不高,但与癌旁组织相比乳腺癌样本中PRKAR1A表达明显下降(P=0.024)。2)依托泊苷在体外对MDA-MB-231、MCF7细胞系杀伤作用明确,最佳工作条件分别为200 n M(24小时)和500 n M(12小时)3)给予PKA激活剂或抑制剂可以改变CREB磷酸化水平,PKA抑制剂H89工作条件为2μM,1小时,PKA激动剂Forskolin工作条件为2μM,2小时。4)PKA激动剂Forskolin处理乳腺癌细胞后,p CREB/CREB呈逐渐升高趋势,p ATF2/ATF2呈先升高后下降趋势,其中p ATF2(Thr 71)/ATF2达到最高点时间要比p ATF2(Thr52)/ATF2晚。5)依托泊苷对乳腺癌细胞的杀伤作用可以被PKA抑制剂增强,也可以被PKA激活剂减弱。但是Forskolin对细胞的保护作用可以部分被PKC抑制剂拮抗。6)PKA活性增加可以使核内CREB和ATF2水平增加。其中ATF2的增加可被PKC抑制剂拮抗,并且增加乳腺癌细胞系对依托泊苷的敏感性。7)PKA的活性增高可以使BCL2表达增多,这种增多可能是激活的ATF2介导的,并可以被RO31-8220部分拮抗。结论:总之,PRKAR1A是一个抑癌基因,各种原因导致的其失活性突变或表达下调均可能导致遗传性疾病以及是多种肿瘤的发生。PRKAR1A表达下调会导致PKA活性的异常升高,通过直接激活CREB和间接激活(AKT、ERK、PKC)ATF2促进其向细胞核内转移激活其下游基因如BCL2的表达,并增加肿瘤细胞对化疗药物的耐药性,可能在心脏粘液瘤、乳腺癌及其他内分泌系统肿瘤的发生、发展过程中具有重要意义。