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棉花纤维是人类最主要的天然纤维来源,具有重要的经济价值。棉花纤维是胚珠外表皮特化形成的突起,其发育经历起始、伸长、次生壁合成和脱水成熟四个独立而又重叠的过程。棉花纤维的发育历经不同阶段,伴随着大量基因的转录和翻译。发掘参与纤维发育的基因,解析相关基因的生物学功能,不仅有助于理解棉花纤维发育的分子机制,更对通过基因工程手段定向改良纤维品质,培育优质纤维的棉花品种具有指导意义。本研究从陆地棉(Gossypium hirsutum)克隆了泛素连接酶基因GhHUB2。分析表明GhHUB2在棉花的子叶,根,茎,叶,花,胚珠以及纤维等组织均有表达。GhHUB2定位于细胞核,是一个C3HC4型泛素连接酶,在体外具有自身泛素化活性。GhHUB2可以回补拟南芥组蛋白H2B单泛素化酶基因AtHUB2突变体的早花表型,是AtHUB2的同源基因。为了研究GhHUB2在棉花发育过程中的功能,通过农杆菌介导的遗传转化获得超表达GhHUB2和干扰GhHUB2的转基因棉花材料。GhHUB2不仅影响转基因棉花的开花时间,还影响棉花纤维的发育。对通过自交获得的T3代转基因棉花纤维进行分析,结果发现超表达GhHUB2使得纤维长度相比于野生型增加7.49%-8.99%,而干扰GhHUB2使得纤维长度下降5.85%-8.24%。GhHUB2超表达棉花纤维中纤维素和木质素含量相比于野生型显著提高,细胞壁厚度增厚;相反GhHUB2干扰棉花纤维中纤维素和木质素含量降低,细胞壁厚度变薄。为了探究GhHUB2调控纤维发育的机制,以GhHUB2为诱饵筛选棉花cDNA文库。结果除了获得参与组蛋白H2B单泛素化修饰的因子外,还得到一个纤维优势表达的转录抑制子GhKNL1。通过酵母双杂交实验、萤火虫荧光素酶互补实验以及免疫共沉淀实验证明,GhHUB2能够与GhKNL1互作。体外泛素化实验表明GhHUB2可以多聚泛素化修饰GhKNL1。利用烟草体内降解实验和半体内降解实验证明,GhHUB2促进GhKNL1蛋白通过26S蛋白酶体途径降解。进一步分析棉花纤维发育过程中GhHUB2对GhKNL1影响。首先,通过免疫印迹检测转基因棉花和野生型棉花纤维中GhKNL1蛋白的积累情况。实验结果显示,超表达GhHUB2使得GhKNL1蛋白在纤维发育不同时期的积累量相对于野生型减少,而干扰GhHUB2促进GhKNL1蛋白在纤维中的积累。RT-qPCR分析证明GhHUB2不影响GhKNL1的转录。这表明GhHUB2在纤维发育过程中能够促进GhKNL1蛋白的降解。这一结果还通过无细胞降解实验得到证实。然后,通过RT-qPCR检测已经报道的GhKNL1调控的下游基因的表达。结果表明,GhKNL1下游参与纤维伸长的GhXTH1和Gh1,3-β-G以及参与次生壁合成的GhCesA4,GhAGP4,GhCTL1和GhCOBL4等基因的表达量在GhHUB2超表达株系纤维中显著上调;而GhHUB2干扰株系与之相反。本研究还发现GhKNL1直接结合GhREV的启动子并抑制GhREV的表达。超表达GhHUB2提高纤维中GhREV的表达量;相反,干扰GhHUB2降低GhREV在纤维的表达量。以上研究结果表明GhHUB2促进棉花中GhKNL1蛋白的降解,从而解除GhKNL1对下游参与纤维伸长和次生壁合成相关基因的抑制。综上所述,本研究发现了棉花GhHUB2单泛素化修饰组蛋白H2B以外的新功能:GhHUB2可以与纤维发育的负调控因子GhKNL1互作,泛素化修饰GhKNL1并促进其通过26S蛋白酶体降解,进而解除GhKNL1对下游参与纤维伸长和次生壁合成相关基因及其直接下游GhREV等基因的转录抑制。综合本研究结果和前人研究,本文得出结论:泛素连接酶GhHUB2和转录抑制子GhKNL1精细调控棉纤维发育,保证棉纤维长度和次生壁厚度保持在适当的范围,维持棉花纤维发育的内稳态。