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D-氨基酸是医药和精细化学品中的一种重要手性砌块,常用于合成β-内酰胺类抗生素,生育类药物,抗凝剂和农药。因此,对D-氨基酸的生物合成方法进行研究具有重大的意义。利用海因酶过程、酶法拆分、酶水解以及酶不对称催化潜手性底物等生物方法可以合成D-氨基酸。但是这些方法需要特定的底物,并且底物昂贵不易获得,不适用于工业化的生产。因此,建立一种通用的生物方法从廉价易得的前体出发合成D-氨基酸是具有挑战性的。设计多酶级联的生物催化路线,从廉价易得的起始底物出发,一锅法合成相应的D-氨基酸具有催化成本低,催化效率高,节省操作准备步骤和资源等优点。本论文设计和优化了一条包含氧化脱氨模块（L-氨基酸脱氨酶）和还原氨化模块（D-氨基酸脱氢酶）的级联催化路线,催化廉价易得的L-氨基酸立体异构反转合成D-氨基酸。并利用体外级联和体内级联两种级联催化方式逐步提高级联催化反应的催化效率,实现多种天然和非天然D-氨基酸的合成。主要研究结果如下:（1）基于多酶级联催化,设计了一条包含氧化脱氨模块和还原氨化模块的级联催化路线,催化L-氨基酸立体异构反转合成D-氨基酸。以底物和产物为目标导向,通过文献检索和基因挖掘筛选,确定组成各催化模块的生物催化剂分别为Pm LAAD（氧化脱氨模块,来源于Proteus mirabilis的L-氨基酸脱氨酶）、St DAPDH/H227V（还原加氨模块,来源于Symbiobacterium thermophilum的二氨基庚二酸脱氢酶）和Bs FDH（辅酶循环,来源于Burkholderia stabilis的甲酸脱氢酶）。并对各模块的催化性质进行探究,评价所选催化剂的最适催化条件。Pm LAAD全细胞催化剂在Tris-HCl缓冲溶液（50 m M,p H 7.0-10.0）和45℃下活性更高,最适全细胞催化剂浓度为80 mg/m L。St DAPDH/H227V对苯丙酮酸（PPA）的酶活为0.46 U/mg,kcat值为1.13 s-1。p H值为9.5时St DAPDH/H227V酶活最高,在37-45℃时酶能够保持较高的活性,催化30 m M的PPA,6 h后转化率为100%,产物ee值大于99%。当p H值为7.5,温度为45℃时,Bs FDH酶活最高为2.89U/mg。与St DAPDH/H227V级联组成辅因子循环系统,能够以NADP+作为辅因子而不影响催化效率。并且,Pm LAAD和St DAPDH/H227V在催化过程中无副产物产生,反应始终向产物生成的方向进行。因此,所选择的催化剂能够用于级联催化路线各模块的组装。（2）将氧化脱氨模块、还原氨化模块和辅酶循环系统进行组装,构建了Pm LAAD-St DAPDH/H227V-Bs FDH体外级联催化体系。为了提高级联催化系统的催化效率,对级联催化反应的最适反应条件进行探索。体外级联催化系统的最适催化条件为50 m M Tris-HCl缓冲（p H 9.0）,温度30℃。当Pm LAAD全细胞催化剂浓度为40 mg/m L,St DAPDH/H227V的浓度为4.5 mg/m L,Bs FDH的浓度为0.35 mg/m L时,体外级联催化系统能够催化80 m M的L-苯丙氨酸（L-Phe）完全立体异构反转合成D-苯丙氨酸（D-Phe）,转化率以及光学纯度均可达到100%。此外,该级联催化路线能够高效催化多种天然和非天然的L-氨基酸立体异构反转合成相应的D-氨基酸,如L-Phe、L-高苯丙氨酸、2-氯-L-苯丙氨酸、3-氯-L-苯丙氨酸、L-谷氨酸和L-正缬氨酸。（3）为促进Pm LAAD的蛋白的可溶性表达,提高其整体催化效率,对膜蛋白Pm LAAD的可溶性表达进行了研究。通过与麦芽糖结合蛋白（MBP）标签的融合表达,Pm LAAD成功的解除了膜结合状态,并实现了可溶性活性表达。随后对Pm LAAD粗酶液、MBP-Pm LAAD粗酶液、MBP-Pm LAAD纯酶、Pm LAAD纯酶的酶活进行分析。以L-Phe为底物时,MBP-Pm LAAD纯酶的酶活最低为0.025μmol/（mg Pm LAAD·min）,MBP-Pm LAAD粗酶液的酶活最高为0.17μmol/（mg Pm LAAD·min）,是Pm LAAD粗酶液酶活的2.2倍。对MBP-Pm LAAD的催化特性进行分析发现,酶的最适催化条件为37℃和p H 8.5,在此条件下存储10 h酶活仍保持稳定,并且外源添加FAD对酶活无影响。与MBP标签融合后,MBP-Pm LAAD粗酶液的活性远高于膜结合的Pm LAAD全细胞。MBP-Pm LAAD粗酶液能够催化100 m M的底物L-Phe在6 h内完全转化为PPA。因此MBP不仅能够促进膜蛋白Pm LAAD的可溶性表达,同时能够促进其催化活性的提高。（4）设计和构建了包含Pm LAAD、St DAPDH/H227V和Bs FDH的体内级联细胞工厂。为了构建体内级联系统,评估了三种调节酶表达水平的策略,分别为单质粒多基因共表达策略、双质粒多基因共表达策略和双质粒MBP融合的多基因共表达策略。通过探究表达条件对共表达菌株蛋白表达以及催化活性的影响,筛选出具有最高催化效率的双质粒MBP融合共表达菌株E.coli p ET-21a-MBP-pmlaad/p ET-28a-stdapdh/H227V-bsfdh。随后对最适催化条件进行探究,在最佳条件下,75 mg/m L的E.coli p ET-21a-MBP-pmlaad/p ET-28a-stdapdh/H227V-bsfdh全细胞催化剂,通过添加0.1倍底物浓度的NADP+和2倍底物浓度的甲酸铵能够催化150m M的L-Phe完全转化为D-Phe,24 h产率和光学纯度可达99%以上,与体外级联催化体系相比,底物浓度提高了1.9倍。此外,利用体内级联细胞工厂能够高效地将多种廉价易得的芳香族和脂肪族L-氨基酸（如L-酪氨酸、L-Phe、L-高苯丙氨酸、2-氯-L-苯丙氨酸、3-氯-L-苯丙氨酸、4-氯-L-苯丙氨酸、L-亮氨酸、L-正缬氨酸、L-谷氨酸和L-甲硫氨酸）立体转化为相应的D-氨基酸,转化率为45.3%-100%,光学纯度大于99%。（5）通过100 m L制备级转化实验,进一步验证了本研究所构建的体内多酶级联催化体系合成D-氨基酸的潜力。通过对放大反应条件的优化,E.coli p ET-21a-MBP-pmlaad/p ET-28a-stdapdh/H227V-bsfdh全细胞催化剂在100 m L放大反应规模中能够催化200 m M的底物L-Phe,48 h后产物转化率和光学纯度均达到100%,分离产率为91%。最后通过MS、1H-NMR和13C-NMR对纯化产物进行分析和鉴定,鉴定结果表明产物结构正确,进一步证明了本研究所构建的体内级联细胞工程的准确性和普遍适用性。