【摘 要】
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目的：利用大肠杆菌原核表达体系表达5-脂氧合酶和15-脂氧合酶，并对重组的蛋白进行纯化、鉴定及活性检测，为其抑制剂的筛选奠定基础。方法：用PCR技术对5-脂氧合酶和15-脂氧合酶基
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目的：利用大肠杆菌原核表达体系表达5-脂氧合酶和15-脂氧合酶，并对重组的蛋白进行纯化、鉴定及活性检测，为其抑制剂的筛选奠定基础。方法：用PCR技术对5-脂氧合酶和15-脂氧合酶基因进行扩增，得到的目的基因与pET-15b原核表达载体连接，将鉴定连接成功的重组表达质粒pET-15b-h5-LOX和pET-15b-m15-LOX转入原核表达工程菌gami进行表达。考察诱导剂IPTG浓度，表达温度，及诱导培养时间，从而确定最优表达条件，SDS-PAGE凝胶电泳检测表达结果，显示得到包涵体形式的目的蛋白，在体外进行变性复性条件优化。纯化复性后的蛋白进行活性检测，并用HPLC法初步筛选其抑制剂。结果：经PCR扩增得到了大小分别为2025bp和1992bp的5-LOX和15-LOX基因片段。经核苷酸序列检测，证明表达质粒pET-15b-h5-LOX和pET-15b-m15-LOX构建成功。在gami菌中诱导蛋白表达后SDS-PAGE凝胶电泳检测显示，分别在相对分子量80.6kDa和78.0kDa附近出现5-LOX和15-LOX目的蛋白条带，在25℃，0.1mmol/L IPTG条件下，诱导24h，蛋白表达量最高，且经纯化条件优化，包涵体用1.5mol/L尿素洗涤后，5-LOX蛋白占总菌体蛋白的比例分别由12.6%提高到69.2%，15-LOX蛋白由5.4%提高到64.2%。纯化后的目的蛋白溶解在8mol/L尿素中，体外复性后，HPLC法检测有良好的活性，检测得到四种二咖啡酰奎宁酸类化合物BR1、BR2、BR3和BR4对5-LOX的IC50分别为9.30.20μmol/L、27.10.88μmol/L、25.92.88μmol/L、3.10.54μmol/L，对15-LOX的IC50分别为6.04.12μmol/L、16.72.35μmol/L、6.90.96μmol/L、7.54.71μmol/L，结果显示这几个咖啡酰奎宁酸化合物可以显著抑制5-LOX和15-LOX活性。结论：本实验在原核表达体系大肠杆菌中成功表达了5-脂氧合酶和15-脂氧合酶，并优化了表达纯化条件。体外检测了活性，并检测了四个咖啡酰奎宁酸化合物对5-脂氧合酶和15-脂氧合酶的抑制作用。
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