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猪2型圆环病毒(Porcine circovirus2,PCV2),是至今为止发现的最小的动物病毒之一。其主要引起断奶仔猪多系统衰竭综合征,对规模化养殖场造成了不可估量的损失。由于其可引起免疫器官的病理变化,使猪自身的免疫系统受损,更加剧了其他病原菌的侵入,加重病情。现在越来越受到养殖者和科研工作者的关注。 本试验从山东省收集了多份PMWS疑似病料,并根据PCV2的Cap蛋白通过Prime5设计了一对特异性引物,用来检测。将阳性病料再经过磷钨酸染色,在透射电镜下观察。莱西的病料中观察到了17 nm左右的PCV2病毒粒子。并将病料接种到PK-15细胞中,用D-氨基葡萄糖处理,增加病毒的感染量。连续盲传6代,并用PCR来检测每代收获的病毒液。经检测,全为阳性。为接下来的试验提供了试验材料。 根据GenBank中己发表的PCV2全基因序列,设计一对特异性引物,用PCR方法直接从接毒细胞中扩增出PCV2的全基因组序列。将扩增片段克隆于pMD19-T载体进行测序,结果表明PCV2基因组全长为1767bp。应用DNAstar分析结果表明,在1479 bp-1468 bp处都含有特殊的TCA/AAC/CCC/CG(T)C序列,所以基因型为PCV2-1型。同时与选取的国内外23株已公布的序列进行系统进化树比较,确定其基因亚型为PCV2-1B,并命名为LX株。再选取山东地区的6株序列进行分析,核苷酸序列的同源性均超过96.9%,同源性较高,其3个ORF均出现了突变。ORF1和ORF3没有引起氨基酸的变化,而ORF2有2处氨基酸发生突变,128 R-W,179 S-F,而128位位于PCV2独特的抗原位点,推测影响PCV2的抗原性,进而影响毒力。 将pMD19-T-PCV2用SacⅡ单酶切,回收PCV2全基因。同时将目的载体pBLuescript KS载体用SacⅡ单酶切回收,并用去磷酸化酶CIAP处理,防止载体自连。将PCV2-1B与pBluescript KS连接,获得了两个重组克隆载体,分别命名为pBluescript KS-PCV2(+)和pBluescript KS-PCV2(-)。将2个载体转染PK-15细胞,通过RT-PCR检测,结果表明构建的PCV2克隆具有感染性,但是pBluescript KS-PCV2(+)的感染性较强。 本研究成功克隆出PCV2的全基因,并构建了两个感染性克隆,为PCV2的致病机理和新型疫苗的研制提供了技术和理论依据。