论文部分内容阅读
目的: 1 IRF8在非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer, NSCLC)组织的表达和启动子甲基化状态; 2验证IRF8对人NSCLC细胞增殖,周期阻滞,诱导凋亡,迁移侵袭能力等细胞功能的调控作用; 3探讨介导IRF8抑癌作用的可能机制,是否参与Wnt信号通路,及其与Wnt通路的相互作用。 方法: 1.采用实时荧光定量PCR检测IRF8在人肺癌组织和癌旁组织中的表达情况;分析The MethHC database tool(http://methhc.mbc.nctu.edu.tw/)数据库中,IRF8在正常肺组织和NSCLC组织中的表达和甲基化情况;通过Kaplan-Meier plotter data base(http://kmplot.com/analysis/),分析IRF8表达与 and NSCLC患者生存期的关系; 2.使用甲基化特异性PCR(Methylation-specific PCR,MSP)检测IRF8在人肺癌组织中的启动子甲基化情况;采用去甲基化药物处理后,检测IRF8的表达和甲基化。 3.体外细胞功能中,使用克隆形成实验, MTS实验检测IRF8对NSCLC增殖能力的调控作用;使用transwell小室检测IRF8对NSCLC侵袭迁移能力的影响;采用流式细胞术检测IRF8对细胞凋亡和周期的影响;进一步采用三维细胞培养检测IRF8对细胞形态的改变。MTS检测IRF8对肺癌细胞顺铂敏感性的影响。采用AO/EB染色和流式细胞仪检测IRF8对NSCLC细胞凋亡的诱导作用,并用Western blot检测与凋亡相关的基因,PARP, BAX, p53的变化。采用流式细胞仪检测IRF8对肺癌细胞A549、H1299的细胞周期的调控作用,并采用Western blot检测IRF8与细胞周期相关的p21和p21的调控作用。 4.体内实验中,使用裸鼠成瘤实验进一步在体内证实IRF8对NSCLC体内增殖能力的调控作用。 5.在JASPAR数据库(http://jaspardev.genereg.net/),预测IRF8的可能靶基因。采用Chip-qPCR检测IRF8与LEF/TCF的启动子的结合,RT-PCR进一步验证两者结合。采用荧光素酶报告系统检测IRF8与LEF/TCF启动子结合是转录激活还是转录抑制。RT-PCR从mRNA表达层面进一步验证IRF8对LEF/TCF转录活性的影响。Western blot验证IRF8对LEF/TCF及beta-catenin及其下游基因C-myc, CyclinD1,MMP-7的表达,以及验证IRF8对Wnt通路的影响。 6.采用免疫荧光检测IRF8对beta-catenin核转位的影响。 7.采用MSP检测NSCLC组织IRF8启动子甲基化的状态,采用Student-T test分析IRF8启动子甲基化与患者临床病理参数的关系,预期IRF8可能成为NSCLC的早期诊断和疗效评判的靶点。 结果: 1.在26对癌和癌旁组织中,与癌旁组织比较,80.8%(21/26)的肺癌组织IRF8呈低表达(P<0.0001),因此IRF8是一个在肺癌频繁低表达的基因;分析数据库MethHC data base, IRF8在肺腺癌和鳞癌组织低表达,启动子高甲基化。进一步在Kaplan-Meier plotter data base分析IRF8表达和NSCLC患者生存期关系,结果显示IRF8 mRNA高表达患者比低表达患者有更长的无病生存期[相对危险度(HR)=0.73 p=1.3e-06]。 MSP结果提示NSCLC组织中IRF8高甲基化75.9%(41/54),而癌旁组织中只有24.1%(13/54)甲基化。A+T实验进一步提示,去甲基化药物5-Aza-2’-deoxycytidine(5-Aza) and trichostatin A(TSA)处理后,RT-PCR结果显示IRF8重新表达。 2.细胞功能实验中,MTS和平板克隆形成实验证实IRF8过表达能抑制肺癌细胞A549,H1299增殖;Transwell小室提示重新表达IRF8抑制肺癌细胞的侵袭迁移能力;流式细胞术提示过表达IRF8阻滞细胞周期于G0/G1期,Western blot提示IRF8上调周期相关的p21和p27表达;流式细胞术还提示IRF8诱导肺癌凋亡,AO/EB实验进一步从形态学上证实IRF8过表达,使凋亡细胞增多,Western blot从蛋白水平证实外源性表达IRF8使凋亡相关的蛋白BAX,p53, cleaved-PARP表达上调(H1299细胞株p53不表达);MTS还进一步从药物敏感性方面,证实IRF8过表达可以增敏肺癌细胞对顺铂的敏感性;三维细胞培养从形态学上揭示IRF8使肺癌细胞失去微管和伪足,变为侵袭性相对较低的类圆形。 3.体内裸鼠成瘤实验显示IRF8体内抑制裸鼠成瘤,并降低Ki67表达。 4.通过 JASPAR数据库预测 LEF1可能是 IRF8潜在的靶点, Chip-qPCR进一步验证IRF8和LEF1启动子的结合, qPCR产物进行RT-PCR显示IRF8和LEF1的结合。荧光素酶报告系统提示IRF8抑制beta-catenin的转录活性, RT-PCR进一步显示IRF8抑制LEF1、TCF4 mRNA表达。Western blot提示 IRF8抑制 Wnt信号通路 Active-beta catenin、TCF4及其下游靶基因C-myc, Cyclin1及MMP-7。IRF8进一步阻断Wnt激动剂bml284对Wnt通路的激动作用提示IRF8参与了Wnt通路。 5.细胞爬片免疫荧光,进一步验证IRF8过表达影响了beta-Catenin核转位。 6.MSP检测54对癌和癌旁组织IRF8启动子甲基化状态。统计分析显示IRF8甲基化与NSCLC分期、预后、淋巴结转移、组织学分型相关(P<0.05),与年龄、性别、肿瘤大小、有无远处转移、吸烟状态等没有相关性。 结论: 1.IRF8在NSCLC组织低表达,高甲基化与患者分期、预后、淋巴结转移、组织学分型相关。 2.IRF8抑制肺癌细胞增殖、侵袭、增敏顺铂敏感性、诱导G0/G1细胞周期阻滞和凋亡。 3.IRF8通过与LEF1启动子结合,抑制beta-catenin核转位及其转录活性,抑制其下游基因,参与Wnt信号通路。