猪胚胎附植阶段子宫腔液中细胞外囊泡小RNA测序分析及miR-92b-3p功能研究

来源 :华中农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:yanyingguilai
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胚胎附植的成功与否是影响母猪产仔数高低的关键因素,在子宫腔液中的细胞外囊泡(Extracellular vesicles,EVs)可以通过介导胚胎与母体子宫内膜之间的交流来影响胚胎附植。我们以妊娠第10、13和18天(D10、D13和D18)的子宫腔冲洗液(Uterine flushing fluids,UFs)中的EVs为研究对象,然后提取子宫腔冲洗液中的细胞外囊泡(UFs-EVs)的小RNA进行测序和生物信息学分析。为进一步了解UFsEVs对猪子宫内膜上皮细胞(EEC)和胚胎滋养层细胞(PTr2)的影响,我们将D13的UFs-EVs处理EEC和PTr2细胞后,提取两组细胞的RNA进行转录组测序和分析。最后,我们筛选出在D10、D13和D18的UFs-EVs中差异表达的mi R-92b-3p,并研究了来源于EEC的EVs包裹的mi R-92b-3p(EVs-mi R-92b-3p)对PTr2细胞的功能影响及其调控机制。主要得到以下结果:(1)通过透射电镜观察到在胚胎附植期间的猪子宫内膜组织中包裹多个杯状囊泡类结构的多泡内泌体。通过扫描电镜发现在胚胎附植期的胚胎表面具有直径为100-400 nm球状小囊泡黏附。免疫组织化学试验表明与EVs分泌和摄取相关的蛋白CD9在猪胚胎附植过程的D10、D13和D18的子宫内膜腔上皮细胞中和D18的胎盘滋养层细胞中都有表达。(2)本研究对D10、D13和D18母猪的UFs-EVs进行了分离,并使用蛋白免疫印迹、透射电镜和纳米粒子粒径分析技术鉴定出UFs-EVs为CD63、CD9和HSP70阳性,Calnexin阴性以及粒径为40-160 nm的杯状EVs。然后对这些UFs-EVs中的小RNA表达谱进行了全面的分析。共鉴定出152个已知的micro RNA(mi RNA)、43个新的mi RNA、6248个已知的piwi-interacting RNA(pi RNA)和110个新的pi RNA。RT-q RCR结果表明,在这些小RNA中,ssc-let-7f-5p、ssc-let-7i-5p和ssclet-7g在三个时期差异表达。生物信息学分析表明,D10 vs D13、D13 vs D18和D10vs D18的3个比较组中差异表达的mi RNA参与了与免疫调控、子宫内膜容受性和胚胎发育相关的生物学过程和通路。(3)将UFs-EVs在PKH67标记之后与EEC和PTr2细胞共培养12h和24h。激光共聚焦观察发现荧光标记的UFs-EVs可以被EEC和PTr2细胞摄取。(4)本研究对D13的UFs-EVs处理过的EEC和PTr2细胞进行转录组测序。在UFs-EVs处理EEC和PTr2细胞后,分别有1793和6279个基因的m RNA表达水平发生了显著的改变。通过RT-q PCR检测发现了ID2、ITGA5、CXCL10、CXCL11在两细胞的对比组中都差异表达。生物信息学分析表明EEC和PTr2细胞在处理后差异表达的基因与免疫调控、细胞迁移、细胞黏附以及EVs的分泌和摄取相关。(5)从EEC细胞培养基中分离出EVs,并通过鉴定了蛋白免疫印迹、透射电镜和纳米粒子粒径分析技术鉴定了EEC细胞释放的EVs。我们使用CM-Dil对来源于EEC细胞的EVs进行染色并与PTr2细胞共培养,通过激光共聚焦观察发现荧光标记的EVs可以被PTr2细胞摄取。(6)通过Transwell共培养体系发现FAM标记的mi R-92b-3p转染的猪原代EEC细胞可以通过EVs的形式传送mi R-92b-3p到PTr2细胞中,并且EVs-mi R-92b-3p可以被PTr2细胞摄取使得mi R-92b-3p在PTr2细胞中的表达水平显著上调。EVsmi R-92b-3p和mi R-92b-3p都可以显著促进PTr2细胞的增殖、迁移和黏附。双荧光素酶分析发现mi R-92b-3p可以靶向TSC1和DKK3,且mi R-92b-3p可以抑制TSC1和DKK3的m RNA和蛋白质的表达。功能回复试验表明TSC1和DKK3的3’UTR载体可以回复mi R-92b-3p对PTr2功能的影响。此外,在小鼠子宫内干涉mi R-92b-3p会导致胚胎附植数量的降低。
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