目的:mTOR(mechanistic target of Rapamycin)是一类在真核生物中高度保守的非典型丝氨酸/苏氨酸激酶,细胞内主要存在mTORC1和mTORC2两种复合体。mTOR参与众多细胞生物学过程。在低等生物酵母细胞中,mTOR具有调控细胞骨架的功能,但在哺乳动物细胞中它是否能够调控细胞骨架一直存在争议。本课题旨在探讨mTORC1对细胞骨架之一的微管系统(microtubule)的稳定性的影响以及雷帕霉素(Rapamycin)与微管靶点化疗药物联用对微管系统的调控。方法:1.采用免疫荧光技术,观察雷帕霉素预处理组和未处理组细胞对微管解聚药物诺考达唑的抵抗能力,从而评估微管的稳定性。2.采用蛋白免疫印迹技术,检测经雷帕霉素处理后,微管靶点化疗药物诱导肿瘤细胞凋亡的能力。3.采用shRNA技术和Crispr-Cas9技术构建ATG5缺陷细胞系。4.采用免疫荧光技术,观察ATG5正常组和缺陷组细胞对诺考达唑的抵抗能力。5.采用蛋白免疫印迹技术,检测mTORC1不同活化程度下,Stathmin、KIF2A、CLIP-170等微管相关蛋白的表达变化。结果:1.在雷帕霉素预处理过的HeLa细胞中,诺考达唑解聚微管的能力相比于对照组明显降低。2.使用雷帕霉素稳定微管后,紫杉醇与诺考达唑诱导肿瘤细胞凋亡能力降低,而对照组依托泊苷诱导肿瘤凋亡能力并没有降低。3.在ATG5敲低和敲除的细胞中,诺考达唑解聚细胞微管结构的能力与对照组相比并无太大差异。结论:1.雷帕霉素能够增强微管的稳定性,mTORC1负性调控微管稳定性。2.雷帕霉素稳定微管可以抑制微管靶向化疗药物的肿瘤细胞的杀伤作用。3.雷帕霉素稳定微管的能力与细胞自噬无关。细胞自噬的发生需要稳定的微管,但是微管的稳定不需要细胞自噬的参与。