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研究背景:卵巢癌是女性致死率最高的妇科肿瘤,其中最常见的是上皮性肿瘤。由于卵巢癌早期症状不明显而且缺乏敏感性比较好的早期检测指标所以大多数患者发现疾病时已为肿瘤的晚期并伴随远处转移,且后期治疗后,上皮性卵巢癌病人5年生存率仍较低。虽然近几年有很多关于卵巢癌发生发展机制的研究,但是并没有一个很好的定论,肿瘤发生发展的潜在分子机制还没有完全阐明。近期研究发现,负性共刺激分子B7-H3与卵巢癌的发生发展密切相关,患者不良预后。B7-H3分子是2001年新发现的基因,其蛋白结构于2013年被确定,但是其受体尚未明确。目前已发现它是在多种肿瘤细胞和抗原提呈细胞中表达的跨膜蛋白。此分子不仅以膜蛋白形式的存在,在血清中还以可溶的形式(soluble B7-H3,sB7-H3)存在,主要是膜蛋白经金属蛋白酶剪切而来。B7-H3分子是B7/CD28家族的成员之一,B7家族分子属于免疫球蛋白超家族,该家族分子具有共刺激T细胞抗原和与其受体结合的作用。最新的研究发现B7-H3分子在多种肿瘤中高表达,包括:结肠癌,肝癌,肺癌,膀胱癌,乳腺癌和前列腺癌。研究发现B7-H3在不同的肿瘤中作用不同,不仅可提供增强和促进T细胞免疫应答的刺激信号,还可产生抑制信号,限制和减弱T细胞免疫反应,在肿瘤、炎性疾病、器官移植中发挥重要作用,成为免疫学及其他学科的研究热点。此外,有文献报道B7-H3还通过Jak2-Stat3通路与患者不良预后有关。虽然,有关文献已经报道过B7-H3在卵巢癌中的表达量,但仅证明B7-H3在卵巢癌组织中高表达,与卵巢癌分期分级有关,没有进一步研究B7-H3分子发挥作用的机制。目前报道B7-H3对卵巢癌细胞的生物学行为的影响及其作用机制的相关文献几乎没有。研究目的:B7-H3分子在卵巢癌中表达,但是它在卵巢癌中具体的影响及其作用机制尚不清楚。通过本项目进一步验证该分子在卵巢癌及正常卵巢上皮组织中表达情况,分析B7-H3分子表达量情况与患者临床病理特征的关系,探讨B7-H3分子对卵巢癌细胞生物学行为的影响及其发挥作用的机制,为卵巢癌免疫治疗提供新的靶点和理论依据。方法:1.利用免疫组化的方法检测卵巢癌组织及正常卵巢上皮组织的B7-H3表达情况并分析其与患者临床病理特征的相关性。2.通过免疫荧光的方法对B7-H3在卵巢癌细胞中表达位置进行检测。3.通过MTT方法检测B7-H3过表达/干扰后卵巢癌细胞的增殖能力的变化。4.通过Transwell迁移和侵袭实验检测B7-H3过表达/干扰后卵巢癌细胞的迁移和侵袭能力的变化。5.通过流式细胞计数法检测B7-H3过表达/干扰后对卵巢癌细胞的周期和凋亡能力的影响。6.通过免疫蛋白印迹方法检测B7-H3干扰及过表达后各种抗凋亡蛋白、促凋亡蛋白相关分子表达量,各种与细胞侵袭,迁移,增殖有关的分子表达量及与B7-H3发挥作用有关的Jak2-Stat3通路有关的分子表达量。7.小干扰RNA(siRNA)-B7-H3用来干扰掉A2780细胞和SKOV3细胞中B7-H3的表达;B7-H3慢病毒用来建立B7-H3稳定干扰卵巢癌肿瘤细胞(A2780-sh-B7-H3,SKOV3-sh-B7-H3)和稳定过表达卵巢癌肿瘤细胞(HO8910-B7-H3-EGFP)。结果:1.B7-H3分子在卵巢癌患者组织及正常卵巢组织中表达量及其在卵巢癌细胞中的表达位置B7-H3分子在卵巢癌组织中高表达,在正常卵巢上皮组织表达量很低或不表达。B7-H3表达于卵巢癌细胞中的细胞膜及细胞质中。2.B7-H3分子表达量与患者临床病理特点之间的相关性B7-H3分子表达量与患者卵巢肿瘤分期有关,但是与患者年龄,肿瘤大小,分级,淋巴脉管浸润没有相关性。3.干扰掉B7-H3分子后卵巢癌细胞的侵袭、迁移能力的变化干扰掉B7-H3分子后,A2780细胞和SKOV3细胞的侵袭、迁移能力减弱,与之相关的蛋白分子MMP2的表达减弱。4.干扰掉B7-H3分子后卵巢癌细胞的增殖、凋亡能力的变化干扰掉B7-H3分子后,A2780细胞和SKOV3细胞增殖能力相应的减弱,相应停留在细胞分裂期的细胞相对减少;而细胞的凋亡能力则相应增加,尤其是增加早期凋亡的细胞。其中与细胞凋亡相关的蛋白分子促凋亡分子Bax,caspase-8,cleaved caspase-8表达量增加,抗凋亡分子Bcl-2,Bcl-xl表达下降。5.过表达B7-H3分子对卵巢癌细胞的侵袭、迁移、增殖能力的影响过表达B7-H3分子后,卵巢癌细胞HO8910的侵袭、迁移、增殖能力增强。相应的与之相关的蛋白分子促凋亡分子Bax,caspase-8,cleaved caspase-8表达量减少,而抗凋亡分子Bcl-2,Bcl-xl及侵袭相关分子MMP2的表达增强。6.B7-H3对Jak2-Stat3通路的影响随着B7-H3的过表达,HO8910细胞中磷酸化Stat3分子及其上游分子磷酸化Jak2相应的增加;抗凋亡蛋白分子表达增强而促凋亡蛋白表达相应减少。用Jak2抑制剂AG490对过表达B7-H3细胞进行处理48h后,则相应的有关分子发生相反的变化。结论:1.B7-H3分子在卵巢癌组织中高表达,其表达与卵巢癌的病理分期有关,与患者的年龄,肿瘤大小等其他病理特征无关。2.B7-H3影响卵巢癌细胞的生物学行为,促进肿瘤细胞的侵袭,迁移,增殖能力,减弱肿瘤细胞的凋亡能力。3.B7-H3分子在卵巢癌中发挥作用与Jak2-Stat3通路有关。