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研究背景肝脏是人体重要的组织器官,在机体的物质代谢和能量转换中占有极其重要的地位。部分肝切除术是现阶段临床上治疗各种先天性肝脏疾病、肿瘤性肝脏疾病、创伤性肝脏疾病、感染性肝脏疾病最主要的手段。如何快速有效地促进术后残余肝脏组织再生和修复以代偿受损肝功能是肝脏外科急需解决的问题。间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）,由于其低免疫原性、多能分化性及旁分泌特性,已被广泛用于治疗多种组织器官损伤。间充质干细胞外泌体（MSC-Exos）是细胞分泌的纳米级膜性囊泡,被认为是MSCs发挥治疗作用的关键,其可以介导细胞间通讯并通过靶向递送内容物,从而对机体内诸多生理和病理过程进行调控。MSC-Exos有望替代MSCs而发展为一种新型无细胞治疗手段。近年来,MSC-Exos在肝病治疗及肝再生医学领域显示出巨大潜力,大量研究证实,MSC-Exos能促进肝损伤后再生和修复、逆转肝纤维化及改善肝氧化应激损伤等。MSC-Exos能否促进肝切除后肝组织再生修复,相关的研究报道甚少。监测和分析MSC-Exos体内活动轨迹、分布特性及其对术后损伤肝组织的治疗能力,对于推进MSC-Exos支持疗法的临床转化具有重要的作用。近红外二区发光半导体聚合物量子点（Semiconducting polymer dots,Pdots）是一种新型有机纳米荧光材料,具有生物相容性好、稳定性高、荧光亮度强和组织穿透性强等优点,其可作为活体生物成像的理想荧光探针。利用Pdots探针标记MSC-Exos实现其体内示踪成像的研究暂未见报道。本研究首次利用近红外二区发光Pdots体外直接标记人脐带间充质干细胞外泌体（h UC-MSC-Exos）,以70%肝切除小鼠为动物模型,通过近红外二区荧光成像技术示踪h UC-MSC-Exos在体内的生物学分布,同时探究h UC-MSC-Exos对小鼠肝切除后肝组织再生修复的作用。研究目的1.监测h UC-MSC-Exos体内活动轨迹,建立一种新型、高效、精准、可长期追踪的外泌体体内示踪方法;2.探讨h UC-MSC-Exos对肝切除后肝组织再生修复的作用,为肝切除后以h UC-MSC-Exos为基础的无细胞支持治疗方法提供科学的理论依据。研究方法1.从新鲜人源脐带组织中分离、提取并培养出h UC-MSCs,利用显微镜、流式细胞技术、成脂和成骨分化试剂盒对其形态、表型蛋白、分化能力进行鉴定。通过高速离心结合外泌体提取试剂盒的方法从h UC-MSCs培养上清液中分离提取出h UC-MSC-Exos。利用透射电子显微镜（TEM）、纳米颗粒分析仪（Nanosight）、Western Blot对其形态、粒径分布及标志蛋白进行鉴定;2.再沉淀法制备近红外二区发光且偶联葡萄糖分子的Pdots荧光探针（Pdots-Glu）。利用TEM、动态光散射仪（DLS）、吸收及荧光光谱仪对其形态、粒径、吸收光谱和荧光光谱进行鉴定。Pdots-Glu与h UC-MSC-Exos共孵育以标记外泌体（Pdot-Exos）,通过TEM、激光共聚焦显微镜（CLSM）明确标记成功与否。MCF-7细胞在含有不同浓度Pdots-Glu的完全培养基中培养,利用MTT对MCF-7细胞存活率进行计算,以分析Pdots-Glu的细胞毒性;3.建立70%肝切除小鼠动物模型,分组后分别经尾静脉注入Pdot-Exos、Pdots-Glu及PBS溶液,利用小动物活体成像系统监测体内Pdot-Exos的分布情况。生物化学法检测术后血清转氨酶、胆红素和白蛋白水平,Elisa法检测血清TNF-α和IL-6水平,采用HE染色法观察体内残余肝组织形态学改变,通过免疫组化法检测残肝组织中增殖细胞核抗原（PCNA）和凋亡蛋白（Caspase-3）的表达情况。研究结果1.从脐带组织中分离培养的h UC-MSCs为贴壁细胞,镜下呈梭型或纺锤型。流式细胞术结果提示细胞高表达CD29、CD73、CD90和CD105蛋白,而不表达造血蛋白CD34和CD45。分离的h UC-MSCs经过诱导分化后具有成脂和成骨细胞的潜能。h UC-MSC-Exos在TEM下呈大小不一的圆形或椭圆形囊泡状,膜结构清晰。Nanosight分析其直径在50-200 nm,主要集中在100 nm,浓度约4.47×1010个/m L,Western Blot鉴定其表面标志蛋白CD9、CD63呈阳性表达;2.Pdots-Glu在TEM下为球形或类球形的纳米颗粒。DLS测定其粒径主要集中在12 nm。Pdots-Glu可以被405 nm和808 nm波长的激发光有效激发,具备可见光区（400-550 nm）和近红外二区（850-1300 nm）双重荧光发射属性。标记实验中,TEM下可见h UC-MSC-Exos表面及囊泡内部均分布有一定数量的Pdots-Glu。MTT实验证实,Pdots-Glu在10-50μg/m L的浓度范围内对MCF-7细胞存活率影响较小,细胞存活率均大于90%;3.术后1-7天的观察期内,进入小鼠体内的Pdot-Exos除少量分布于双侧肺及脾脏外,绝大多数于肝脏组织中积累。相较于Pdots和PBS组,Pdot-Exos组小鼠术后肝重/体重比的均值始终更高。肝功能监测显示,术后第1、3天Pdot-Exos组小鼠血清ALT、AST、TBIL水平更低（P﹤0.05）,而ALB水平更高。血清炎症因子水平检测提示Pdot-Exos组小鼠TNF-α、IL-6水平在术后第1、3天明显更低（P﹤0.05）。残肝HE染色显示,Pdot-Exos组小鼠局部肝脏组织坏死较少,炎细胞浸润较少。残肝免疫组化显示Pdot-Exos组术后第1、3天Caspase-3阳性细胞比例明显更低（P﹤0.05）,而PCNA阳性细胞比例在术后第1天明显更高（P﹤0.05）。结论1.成功从脐带组织中分离培养出h UC-MSCs,成功从h UC-MSCs培养上清液中分离提取出h UC-MSC-Exos。鉴定结果符合MSCs和外泌体的认定标准;2.成功制备出具有近红外二区发光属性、相容性好、无细胞毒性且表面偶联葡萄糖分子的Pdots荧光探针,即Pdots-Glu。Pdots-Glu可以在体外直接且高效地标记h UC-MSC-Exos。这种新型标记策略不会改变h UC-MSC-Exos形态、粒径和表面标志蛋白等基本特性;3.术后输注的h UC-MSC-Exos除少量分布于双侧肺及脾脏外,绝大多数于残余肝脏组织中积累。h UC-MSC-Exos可以在一定程度上改善肝切除术后肝组织损伤,促进残余肝组织再生和修复,保护肝细胞功能。h UC-MSC-Exos通过抑制炎症反应、促进肝细胞增殖和抑制肝细胞凋亡的机制来达到其治疗效果。