血吸虫病是严重危害人类健康和影响社会经济发展的一种全球性疾病,大约有76个国家或地区流行着血吸虫病,全球感染者达2亿和易感者达7.79亿。我国流行的主要是日本血吸虫,共有7个省份,包括安徽、江苏、江西、四川、湖南、湖北、云南是血吸虫病的流行区。最新统计结果表明感染人数约有42万,尤其在农村和城郊地区,由于人群卫生知识缺乏和基本卫生设施达不到标准要求,该地区人群处于高感染风险中。　　早期、正确的诊断是控制血吸虫病流行的重要环节,筛选、确定吡喹酮治疗对象,考核疗效,及时、准确地评估流行趋势等,成了血吸虫病防治成败的关键。目前血吸虫病诊断主要依靠病原学诊断和血清学诊断。病原学诊断是从粪检中发现虫卵,该方法敏感性低,依从性差,并且耗时耗力;而血清抗体检测不能区分现症和既往感染,无疗效考核价值,因此不能满足血防工作的需要。宿主体内的循环抗原是由活虫产生的,感染一旦停止,宿主体液中的循环抗原会很快消失,因此抗原检测除可诊断现症感染外,还可作为判断疗效的依据。　　排泄-分泌物(excretory- secretory products,ESPs)是最直接与宿主免疫系统接触,从而诱导宿主产生特异性抗体,或其它免疫效应物质的成分。近十几年,随着质谱和二维电泳技术在生物体蛋白质分析和鉴定中的广泛应用。某些蠕虫的不同发育阶段的蛋白质组分析已经取得了较大进展,得到了大量的数据和信息。而日本血吸虫在终宿主体内的主要寄生和致病阶段的ESPs还未见全面报道,成虫和虫卵的ESPs的差异性,特别是免疫相关的ESPs,以及其中的生物标志物鉴定都还有待研究。本研究拟用二维电泳-质谱分析的方法建立终宿主体内日本血吸虫主要发育阶段—成虫和虫卵的ESPs蛋白质谱,并用感染后不同时期的宿主血清识别,以期发现和筛选与诊断和/或免疫调节相关的感染标志物。　　将新西兰大白兔按1000～1500条尾蚴/只感染日本血吸虫尾蚴,49天后剖杀,分别采用门静脉灌注和肝脏粉碎分步过筛的方法分离获得日本血吸虫成虫和虫卵。将成虫和虫卵分别培养(RPMI-1640培养基+青霉素+链霉素)12～48h后,收集上清液纯化浓缩后即为成虫和虫卵ESPs。收集感染后2周及6周血清,用于免疫印迹分析。　　成虫和虫卵的排泄-分泌物经过去盐、浓缩处理后,用裂解液溶解蛋白沉淀, Bradford法测得其蛋白含量分别为0.5μg/μl和0.8μg/μl。间接ELISA法检测结果提示,该ESPs均可被日本血吸虫感染6w的兔血清所识别,说明成虫和虫卵ESPs具有抗原性。SDS-PAGE/Western-blot检测成虫和虫卵ESPs的免疫反应性,发现成虫ESPs能被感染后2周兔血清识别的蛋白条带有4条,能被感染后6周兔血清识别的带有2条;虫卵 ESPs被感染2周和6周兔血清识别的共同蛋白条带有2条,分子量范围在35～40kDa之间。　　将成虫和虫卵ESPs分别进行一维等点聚焦(18cm,pH3-10的IPG胶条)和垂直的SDS-PAGE(12.5％)电泳后得到重复性和稳定性较好的二维电泳图谱。成虫ESPs得到166个蛋白斑点,分子量主要分布在25～70kDa之间,等电点分布在3～10之间,其中有48个相对高丰度蛋白点;虫卵ESPs得到138个蛋白斑点,分子量在25～60kDa之间和170kDa左右,等电点主要集中在3～6.5之间,其中有34个相对高丰度蛋白点。在这些相对高丰度表达的蛋白中,差异表达的蛋白质斑点有40个,其中由成虫表达的有24个,虫卵表达有16个;共同表达的蛋白点12个。用感染后2周及6周兔血清进行免疫印迹反应,结果显示成虫ESPs中能被感染2周兔血清识别的蛋白斑点有6个,能被感染6周兔血清识别的蛋白斑点有4个,主要分布在酸性端;其共同识别的蛋白斑点是A5;虫卵ESPs能被感染2周兔血清识别的蛋白斑点有4个,其中E3,4分别对应成虫ESPs中能被早期血清所识别的点A4,3。　　挑取相对高丰度和/或差异反应蛋白点经过酶解后进行MALDI-TOF质谱鉴定,将获得的肽片段质量指纹图谱用Mascot搜索引擎(http://www.matrixscience.com/)选择用NCBInr数据库进行检索。结果显示成虫ESPs中差异表达的相对高丰度蛋白中已知的蛋白有18种,包括谷胱甘肽转移酶、醛缩酶、脂肪酸结合酶、金属硫蛋白、葡糖醛酸基表异构酶以及肌球蛋白、金属硫蛋白等,与虫体的发育、能量代谢、合成代谢、基因表达的调控有关;另有不明确的假定蛋白7种。虫卵ESPs中相对高丰度的已知蛋白有2个结构域蛋白,一个转座酶,以及烯醇酶,未发现参与代谢的酶解蛋白。成虫ESPs中能被感染后2和/或6周血清所识别的有裂解酶、氧化酶和一些未知蛋白,其中能被2周和6周血清都识别的A5点,未发现与已知蛋白匹配。肌球蛋白(A10)与感染后2周的血清反应明显,而不与感染后6周的血清反应。虫卵ESPs中烯醇酶是能与感染后2周血清所识别的较清晰的点。　　本研究通过2-DE结合MS对体外培养的日本血吸虫成虫、虫卵ESPs进行了初步研究,发现了差异表达的蛋白质斑点40个,其中由成虫表达的有24个,虫卵表达的有16个。成虫ESPs多为参与虫体代谢、组成表膜、以及与基因调控有关的组份;而虫卵则缺乏代谢反应酶,主要是一些结构域蛋白,与基因调控有关。在相对高丰度差异表达蛋白中,免疫印迹结果发现虫卵烯醇酶、成虫的肌球蛋白等功能清楚的蛋白以及几种假定蛋白可能具有早期诊断的价值,下一步我们将对这些蛋白进行更进一步研究,特别是其在疗效考核中的价值。