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大豆（Glycine Max）是蛋白质和油脂的重要来源,近年来,干旱、盐和金属等多种非生物和生物胁迫严重影响了大豆的生长发育。在植物调节干旱胁迫过程中,转录因子发挥重要作用。作为植物特异性转录因子的最大家族之一,NAC蛋白的N端是能和Ca MV 35S启动子特异性结合的高度保守的NAC结构域,C端作为控制转录激活的调控区域。大量研究表明NAC转录因子在植物抵御植物逆境胁迫的分子过程中发挥重要作用。本研究通过蛋白质组学分析抗旱大豆吉育47的根系,鉴定了一些与干旱相关的蛋白,从表达量上调的蛋白中选择转录因子GmNAC3基因进行克隆,利用生物信息学分析和RT-q PCR等技术,对GmNAC3蛋白生物学特征,基因表达模式和抗旱性分析等方面进行研究,初步明确GmNAC3的调控方式与途径,本研究也为大豆抗逆分子育种提供候选基因。研究的主要结果如下:1、以干旱胁迫24h的大豆吉育47根系为实验材料,从根系中提取蛋白并通过质谱分析鉴定到8687个蛋白,7875个蛋白可定量,通过蛋白差异分析可定量的蛋白发现468个蛋白的水平发生改变,其中324个蛋白下调,144个蛋白上调,包括转录因子GmNAC3蛋白。2、以大豆吉育47根系为材料,利用RT-PCR法克隆获得GmNAC3基因的全长,生物信息学分析该基因完整编ORF包括1452bp,编码483个氨基酸;分子量53.6k Da,理论等电点为4.81,为不稳定的亲水蛋白,不含信号肽,定位于细胞核上。GmNAC3含有一个相对保守的NAM结构域,与野大豆亲缘关系最近,氨基酸序列一致性为99.59%。3、通过构建pBridge-GmNAC3酵母表达载体进行酵母自激活实验,证明GmNAC3蛋白具有转录激活活性;构建p CAMBIA1302-GmNAC3瞬时表达载体,转化本氏烟草进行亚细胞定位实验,证明GmNAC3蛋白定位在细胞核上。生物学特征分析表明GmNAC3符合转录因子的基本特征。4、为研究GmNAC3基因在开花结荚期的表达情况,选取吉林农业大学试验田整株大豆为实验材料,测定根、茎、叶、花、荚中GmNAC3基因的相对表达量。开花结荚期GmNAC3基因在根、茎、叶、花、荚中均表达,在大豆叶片中表达量最低,在大豆根系中表达量最高,为叶片的8倍;为了探究干旱条件下大豆根系GmNAC3基因的表达模式,实验室进行大豆水培实验,利用含20%PEG6000的营养液模拟干旱处理42h,以处理0h的大豆根系为对照,每6h取样一次。结果表明,干旱胁迫可促进GmNAC3基因表达,GmNAC3基因表达量呈单峰曲线,12h时最高,是对照的16倍,42h时达到最低,是对照的3倍。5、构建植物表达载体pCAMBIA3301-GmNAC3-GFP,利用农杆菌介导法获得转基因大豆发根,用20%PEG6000模拟干旱处理12h的转基因发根为实验组,未干旱的转基因发根为阳性对照,处理的转空载体的发根为阴性对照,测定根系抗旱相关生理生化指标,与对照组相比,实验组SOD、POD、CAT活性及Pro含量均有所提高,MDA含量降低。为进一步探究GmNAC3基因的分子调控机制,本实验又测定了部分与抗旱相关基因的相对表达量,结果表明,实验组中LEA14、GSH-PX、6PGD、P5CS的表达均上调,而APX2对GmNAC3无响应。说明GmNAC3可使植物中H2O2调节酶基因GSH-PX,渗透调节基因P5CS、LEA14和6PGD的表达上调,GmNAC3基因可以通过调节部分干旱相关基因的表达来应对干旱胁迫。6、为了进一步明确GmNAC3基因的抗旱功能,用Agl0农杆菌侵染拟南芥获得转GmNAC3基因拟南芥。发现转基因拟南芥在MS0、3%PEG、6%PEG的培养基上的发芽率和萌发率均高于野生型;抗旱性分析发现,转基因拟南芥更耐旱,复水后的恢复能力也有所提高。上述结果说明过表达GmNAC3基因提高了拟南芥种子在干旱条件下的发芽率,促进生根以及提高干旱复水后的恢复能力。为验证GmNAC3基因干旱条件下的抗氧化能力,以6%PEG胁迫的转基因拟南芥为实验组,不胁迫的转基因拟南芥为阳性对照,6%PEG胁迫的野生型拟南芥为阴性对照,测定抗旱相关生理生化指标,结果发现,与对照组相比,转基因拟南芥中SOD、POD、CAT活性及Pro含量均升高,MDA含量均低对照组,与大豆发根实验结果一致。进一步说明过表达GmNAC3基因可以提高植株的抗旱能力。