红花转录因子CtNF-YB12调控种子油脂含量的作用研究

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红花(Carthamus tinctorius L.),菊科草本植物,是我国重要的经济作物。红花籽油则是以红花籽为原料,从中提取出的一种珍贵的优质食用油,被人们称之为“健康油”和“营养油”。随着人们生活条件的改善,对优质红花食用油的需求量大大增加,从现有的红花种植面积来看,远不能满足市场需求。因此,通过基因工程手段培育高品质的红花新品系迫在眉睫。NF-YB基因家族的LEC1(Leafy Cotyledon 1)型转录因子存在于真核生物中,通过调节脂肪酸(FA)合成和糖酵解过程增加种子的含油量。作为单酶方法的替代方法,转录因子可以更加有效地调控油脂合成。目前已有文章报道,拟南芥、玉米、大豆、油菜等中NF-YB基因家族中的LEC1型转录因子可通过调节脂肪酸FA合成和糖酵解过程增加种子的含油量。本研究从红花基因组数据库中筛选出红花NF-YB家族转录因子(Ct NF-YB),通过生物信息学分析将Ct NF-YB12鉴定为LEC1型转录因子;通过实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术明确了NF-YB基因家族的组织特异性表达模式。在本研究中,我们成功克隆了Ct NF-YB12基因,构建了酵母表达载体p PICZαA-Ct NF-YB12转化毕赤酵母X33,初步验证Ct NF-YB12基因对酵母油脂含量的影响;构建了p TB植物表达载体,Flora dip法侵染了野生型拟南芥和突变体拟南芥,获得了T3代过表达拟南芥和突变体回补拟南芥,进而鉴定Ct NF-YB12基因在拟南芥中的生物学功能。具体研究结果如下:1、从红花基因组数据库中筛选得到了14个高度可信的Ct NF-YB基因,分为I类(非LEC1)、II类(LEC1)和III类(Dr1-like);通过对Ct NF-YB基因启动子的顺式调控元件分析发现其中包含生物/非生物胁迫和植物生长发育相关的顺式作用元件;通过Blast 2 go分析发现大部分Ct NF-YB基因被富集到生物过程、分子功能和细胞成分这三个过程中。2、q RT-PCR结果显示,I类非LEC1基因多在根、叶和花中具有较高表达;II类LEC1基因在种子发育前期表达量较高;III类Dr1-like基因在根、茎和叶中表达水平较高。通过对Ct NF-YB12基因的亚细胞定位实验证明Ct NF-YB12基因定位在细胞核中。3、通过构建酵母表达载体p PICZαA-Ct NF-YB12,并转化酵母菌株发现转Ct NF-YB12基因的酵母菌油脂含量显著增加。4、通过构建p TB植物表达载体并转化拟南芥,获得T3代过表达和突变体回补株系,筛选出转Ct NF-YB12基因的高表达株系和突变体回补高表达株系各3株;过表达Ct NF-YB12拟南芥的种荚较长,种子数目较多且饱满,千粒重显著增加;Ct NF-YB12回补的拟南芥恢复到野生型种子水平。5、过表达拟南芥种子的油脂含量和三酰甘油(TAG)含量较野生型拟南芥显著增加,脂肪酸含量增加,回补的拟南芥种子的油脂、TAG和FA含量恢复到野生型种子中的水平。通过糖代谢和脂代谢分析Ct NF-YB12的表达使种子的可溶性糖、葡萄糖、果糖和蔗糖增加,同时也正调控糖酵解过程关键酶基因和脂肪酸合成关键酶基因表达。6、通过构建酵母表达载体p GBKT7-Ct NF-YB12,验证p GBKT7-Ct NF-YB12不存在转录自激活活性;通过酵母双杂交实验证实Ct NF-YB12可能与Ct NFYC2相互作用。
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