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目的:长期以来,脊髓损伤治疗困难,主要原因在于伤后神经细胞难以再生、功能难以恢复。就现阶段来说,细胞替代治疗是解决这一难题的唯一手段,因而神经干细胞的发现和研究为脊髓损伤的治疗带来了新的希望。但研究者们发现,在缺乏外源性营养支持的情况下,移植到受损的成年哺乳动物脊髓内的神经干细胞生存、迁移和向神经元的分化能力不足,受损的神经功能恢复仍很困难。有鉴于此,基因操作和/或外源性营养因子的提供是有必要的。神经营养素-3(NT-3)能促进神经干细胞生存、迁移和向脊髓内具有的神经元类型分化,而酪氨酸激酶C(TrkC)是NT-3的高亲合力受体。由于一般的神经干细胞不能稳定表达足够数量的TrkC,因此通过基因修饰神经干细胞来增加其TrkC的表达有望提高其在宿主脊髓内的存活率、促进其向各种功能神经元的分化和向远处迁移。本研究先将TrkC基因转染到神经干细胞内,然后观察转TrkC基因的神经干细胞在损伤脊髓内的生存、分化和迁移等情况,并研究转TrkC基因的神经干细胞移植对脊髓损伤后神经功能恢复的治疗作用。 材料和方法:本实验首先根据合成的引物,利用PCR反应产物,采用定向克隆的方法构建TrkC-cDNA真核表达质粒并进行DNA测序分析。后将pEGFP-Cl质粒和TrkC-cDNA质粒进行酶切、重组,从而构建出pEGFP-Cl-TrkC质粒并酶切验证。在此基础上,用脂质体将pEGFP-Cl-TrkC质粒转染到体外培养的神经干细胞中并使用荧光显微镜、免疫荧光双标细胞染色、Western-Blot检测和MTT法等方法观察、研究转染基因的表达情况和转基因后神经干细胞增殖活性的变化。随后采用自创的“三步横旋切法”建立大鼠脊髓半切模型,并将大鼠随机分成正常对照组、脊髓半切组、神经干细胞移植组、神经干细胞移植+NT-3局部使用组、转TrkC基因神经干细胞移植组和转TrkC基因神经干细胞移植+NT-3局部使用组。9天后将转TrkC基因的神经干细胞移植到损伤脊髓内,在细胞移植后0.5月、1月和2个月时分别进行BBB评分以观察大鼠后肢运动功能恢复情况,2个月后采用MEP和SEP检测脊髓上、下行神经传导通路恢复情况,随即进行脊髓免疫荧光双标染色观察转TrkC基因神经干细胞移植到损伤脊髓内后的基因表达情况、转TrkC基因神经干细胞在宿主损伤脊髓内的存活、分化和迁移情况等。