研究背景支气管哮喘(简称哮喘)是最常见的慢性气道炎症性疾病;是目前全球发病率上升最快的疾病之一,发病率平均每10年增加50%。目前,全世界有哮喘患者约2.35亿人,中国约有2千万哮喘患者,是全球哮喘病死率最高的国家之一。因此哮喘发生与发展的分子机制仍是基础和临床研究中的热点问题。气道上皮构成了气道表面的第一道重要的保护屏障,气道上皮细胞的损伤和脱落是哮喘的重要病理学特点,多种因素导致气道上皮损伤与功能失调是哮喘发病的始动因素;哮喘患者气道免疫、炎症和重塑反应也与气道上皮细胞的调控有着十分密切的关系。临床研究发现33.3%以上的哮喘以中性粒细胞炎症为主。Th17具有招募中性粒细胞的功能,与中性粒细胞反应为主的气道慢性炎症密切相关。Th17细胞是一类新的CD4~+T细胞亚群,能够特异性地产生细胞因子IL-17;并且具有激活特异性转录因子核孤儿受体γt(RORγt),诱导Th17细胞的产生及分化。哮喘患者的IL-17的表达水平与哮喘严重程度呈正相关。然而,在哮喘中调控CD4~+T细胞向Th17细胞分化的关键因素及分子机制尚未明了。哮喘是一种伴有气道高反应性的慢性炎症性疾病,而这些炎性蛋白的表达与一些蛋白乙酰化水平有密切关系。sirtuin 1(SIRT1)属于Ⅲ类去乙酰化酶Sirtuin基因家族成员,是细胞内重要的去乙酰化酶,参与机体的多种生理和病理进程,包括细胞周期、转录调节、DNA损伤修复和衰老等,在多种组织如肺组织、血管、脂肪、成纤维细胞、脑血管疾病中表现出显著的抗炎作用。SIRT1调控各种炎症基因的表达,在各类慢性炎症中起重要作用。然而,SIRT1在哮喘气道炎症中是否也有作用?近年研究发现,SIRT1在免疫调节中也具有重要作用。SIRT1可调节巨噬细胞功能,参与T细胞增殖、分化,在维持T细胞耐受中也具有一定作用。SIRT1还可能通过CD38介导的相关途径调节B细胞功能。大量文献报道多种疾病的发生与SIRT1活性水平有关。SIRT1功能紊乱可增加炎症和自身免疫性疾病的发生。目前,关于SIRT1在哮喘发病中的免疫调节作用及具体机制鲜见报道。基于上述目的,本实验通过临床观察哮喘患者血清SIRT1和IL-17的表达情况,并分析其与哮喘患者(尤其是中性粒细胞性哮喘)的临床特征和严重程度的相关性;进一步在体内外实验中探讨SIRT1在哮喘气道上皮细胞损伤中的作用及机制,并探讨SIRT1在CD4~+T细胞向Th17细胞分化中的作用及机制。本课题从以下两个部分进行阐述。第一部分SIRT1在支气管哮喘患者中的表达情况及其与患者临床特征之间的关系目的:通过对临床哮喘患者血清SIRT1和IL-17检测及哮喘疾病严重程度的评价,初步探讨检测SIRT1在哮喘患者中的临床意义。方法:第一部分:选取哮喘患者93人(哮喘组)及健康对照者104人(对照组),通过检测两组病人血清SIRT1、IL-17、血清总Ig E、诱导痰细胞计数、肺功能,哮喘组患者疾病严重程度评估并进行相关分析。结果:哮喘组及对照组血清SIRT1水平分别为2.88±0.41 ng/m L和1.03±0.14 ng/m L,哮喘组血清SIRT1水平明显升高(P<0.01)。相关分析结果显示:哮喘患者血清SIRT1与诱导痰中性粒细胞计数呈正相关(r=0.255,P=0.012);与肺功能FEV1/FVC(%)成负相关(r=-0.290,P<0.01)。哮喘患者血清SIRT1水平与疾病的严重程度分级可能有相关性,但未达到统计学水平(r=0.195,P=0.056)。哮喘组及对照组血清IL-17水平分别为78.12±19.23 pg/m L和33.07±11.74 pg/m L,哮喘组血清IL-17水平明显升高(P<0.01)。相关分析结果显示:哮喘患者血清IL-17与肺功能FEV1(%predicted)呈负相关(r=-0.568,P<0.01);与疾病的严重程度分级呈正相关(F=24.62,P<0.01)。同时,哮喘组血清中的SIRT1水平与IL-17的水平呈正相关(r=0.203,P<0.05)。在完成诱导痰检查的22例哮喘患者中,有13例患者的痰细胞计数以中性粒细胞为主,这组患者的血清SIRT1与血Ig E、血嗜酸性粒细胞计数、IL-17作相关分析,结果显示:患者血清SIRT1水平与外周血嗜酸性粒细胞计数及Ig E水平均无明显相关性,但是与IL-17的水平呈正相关(r=0.284,P=0.009)结论:哮喘患者血清中SIRT1明显升高,且哮喘患者血清SIRT1与肺功能及血清IL-17水平相关,在完成诱导痰检查的哮喘病人中,以中性粒细胞表型为主(占59.10%),并与SIRT1的表达呈正相关;而在中性粒细胞表型的哮喘中,SIRT1与LI-17成正相关,与血嗜酸性粒细胞和血Ig E无关,提示SIRT1可能在哮喘,特别是中性粒细胞型哮喘的发病机制中发挥重要的作用。第二部分SIRT1在支气管哮喘发病中的调控作用及机制研究目的:通过建立中性粒细胞性哮喘小鼠模型和气道上皮细胞模型,探讨SIRT1在哮喘气道上皮细胞损伤中及CD4~+T细胞向Th17细胞分化中的作用及机制。方法:构建中性粒细胞性哮喘小鼠模型,检测支气管肺泡灌洗液中中性粒细胞的比例,HE染色检测中性粒细胞浸润的情况,免疫组化、RT-PCR及免疫印迹检测SIRT1在外周血及气道上皮的表达水平。利用si RNA干扰人气道上皮细胞系HBE的SIRT1表达,给予OVA和LPS进行刺激,采用real-time RT-PCR方法检测中性粒细胞趋化因子及炎症介质。过表达SIRT1的腺病毒感染小鼠脾脏来源的CD4~+T细胞,Th1、Th2或Th17极化的条件下培养,流式检测Th1、Th2及Th17的比例;进一步在体外利用SIRT1重组蛋白干预小鼠脾脏来源的CD4~+T淋巴细胞,检测其向Th17分化的情况。结果:成功构建中性粒细胞性哮喘模型,哮喘小鼠的肺泡灌洗液(BALF)细胞总数明显增加,中性粒细胞比例也明显升高;肺组织病理HE染色进一步显示中性粒细胞浸润明显增多;外周血SIRT1的表达明显高于对照小鼠(P<0.05)。q RT-PCR及免疫印迹均显示哮喘鼠的SIRT1在气道上皮细胞表达明显下降,具有显著统计学差异(分别为P<0.01,P<0.05)。利用si RNA干扰人气道上皮细胞HBE的SIRT1表达,再给予OVA和LPS进行刺激,发现细胞分泌中性粒细胞趋化因子CXCL1、CXCL2及炎症介质IL-8的水平明显增高,且具有统计学意义(P<0.01)。在Th17极化条件下,IL-17A细胞比例在SIRT1过表达的CD4~+T细胞组明显高于对照组,而在Th1(INFγ)和Th2(IL-4)极化条件下,Th1和Th2的细胞在SIRT1过表达及对照组中无明显差异(P>0.05)。在体外利用SIRT1重组蛋白干预小鼠脾脏来源的CD4~+T淋巴细胞,发现SIRT1能促进CD4~+T淋巴细胞向Th17细胞分化。结论:研究发现SIRT1可能从以下两个方面参与哮喘的发病机制:在气道上皮损伤方面,SIRT1起到保护性的作用;而在CD4~+T细胞向Th17方向分化的过程中,SIRT1则是起到促进的作用。